背景与目的:糖尿病视网膜病变（DR）是糖尿病最常见的微血管并发症之一,是导致工作人群首位致盲眼病。目前,临床针对DR的防治方法主要包括全身代谢管理、抗氧化和改善微循环类药物等全身辅助用药,以及眼局部抗炎、抗血管内皮生长因子（VEGF）药物、激光光凝术和玻璃体切割术等。上述DR治疗方法虽取得一定效果,但从长期临床疗效及预后来看,不仅作用有限,而且存在诸多并发症。因此,寻找更为有效、精准和安全的DR防治策略以降低致盲率,是内分泌与代谢病学科及眼科领域亟待解决的重要科学问题。DR的主要病理生理改变为视网膜血管内皮细胞（RVECs）功能障碍,而VEGF则是发挥作用的关键因子,其中以VEGFA为表达量最多且主要的功能亚型。高血糖引起的RVECs功能障碍是导致早期DR血管渗漏和晚期DR血管新生的主要原因,然而,目前调控RVECs功能障碍的作用机制及其中参与调控的关键分子尚未完全阐明。研究发现,环状核糖核酸（circ RNAs）是一种新型内源性非编码RNA,为共价闭合环结构,作为微小RNA（mi RNA）海绵结合并吸附靶mi RNA发挥对下游基因的调控,其表达谱的变化与糖尿病及其多种并发症有关,提示探讨circ RNAs在DR中的作用将拓展对DR发生机制的理解并为临床防治DR创新策略的建立提供理论依据。因此,本研究拟通过circ RNA微阵列分析和多种生物信息学技术的方法筛选可能与DR相关的circ RNAs,挖掘并验证其中差异表达最显著的circ RNA,并探讨其在DR中的调控作用及机制。方法:1.采用circ RNA微阵列芯片技术筛选高糖损伤的人视网膜血管内皮细胞（HRVECs）中差异表达的circ RNAs,选择其中上调最显著的的circ RNA-促分裂原活化蛋白激酶激酶激酶激酶2（c MAP4K2）并从体外HRVECs水平、体内糖尿病小鼠模型视网膜组织及临床DR患者层面验证其与DR的相关性。同时,通过绘制ROC曲线并计算曲线下面积（AUC）以判断选择c MAP4K2作为DR诊断生物标志物的特异度和敏感度。2.体外实验中,将含过表达c MAP4K2的腺相关病毒及c MAP4K2 si RNA转染至HRVECs以上调或下调其表达,通过MTT法检测细胞活力、Ki67细胞增殖实验、细胞迁移实验、细胞成管实验和蛋白印迹法（Western blot）研究调控c MAP4K2表达对HRVECs的细胞功能及其VEGFA表达的影响。体内实验中,小鼠玻璃体内注射含过表达c MAP4K2的腺相关病毒与沉默c MAP4K2的sh RNA腺相关病毒以上调或下调其表达,通过视网膜Evans Blue染色、酶联免疫吸附实验（ELISA）研究调控c MAP4K2表达对DR小鼠视网膜血管渗漏情况、视网膜组织中VEGFA和炎症指标（IL-2、IL-6及TNF-α）表达的影响。3.采用生物信息学分析、RNA荧光原位杂交（RNA-FISH）、RNA免疫共沉淀（RIP）、双荧光素酶报告基因实验、RNA pull-down实验筛选并验证c MAP4K2调控的下游靶mi R-377。采用生物信息学分析、双荧光素酶报告基因和蛋白印迹法（Western blot）预测并验证mi R-377调控的靶基因VEGFA。在体外实验中,将mi R-377 mimic和（或）VEGFA过表达载体转染HRVECs,通过MTT法细胞活力检测、Ki67细胞增殖实验、细胞迁移实验和细胞成管实验验证调控c MAP4K2-mi R-377-VEGFA通路对HRVECs功能的影响;在体内实验中,通过RT-q PCR和ELISA方法验证c MAP4K2-mi R-377-VEGFA通路在DR小鼠视网膜组织、DR患者玻璃体和房水中的表达变化。结果:1.circ RNA微阵列芯片技术筛查,发现在高糖干预HRVECs中47个circ RNAs表达上调、39个circ RNAs表达下调,筛选出其中上调最为显著的c MAP4K2。高糖干预后HRVECs c MAP4K2表达显著上调,糖尿病小鼠视网膜组织c MAP4K2表达显著上调,DR患者玻璃体组织c MAP4K2表达显著增加。绘制ROC曲线的AUC为0.8625,证实c MAP4K2的表达在Non-DR和DR患者间差异显著。2.体外调控c MAP4K2表达可影响RVECs功能,表现为:上（下）调c MAP4K2表达后,HRVECs的细胞活力、细胞增殖能力、细胞迁移和成管能力增强（减弱）,且与VEGFA的表达增加（减低）有关。体内调控c MAP4K2表达可影响糖尿病小鼠视网膜病变情况,表现为:上（下）调c MAP4K2表达后,糖尿病小鼠视网膜血管渗漏加重（减轻）,且与VEGFA及炎症因子（IL-2、IL-6和TNF-α）的表达增加（减低）有关。3.c MAP4K2有2个mi R-377结合位点,其通过结合靶mi R-377（即作为mi R-377的吸附海绵）发挥其转录后水平的调控作用。VEGFA的3’-UTR存在mi R-377结合位点,VEGFA是mi R-377调控的下游靶基因。体外实验中,验证调控c MAP4K2-mi R-377-VEGFA通路对HRVECs功能的影响,表现为:mi R-377过表达导致HRVECs的细胞活力、增殖能力、迁移和成管能力均降低;而过表达VEGFA使mi R-377对HRVECs上述功能的抑制作用减弱;体内实验中,均验证显示c MAP4K2-mi R-377-VEGFA通路在DR状态下的表达改变,表现为:DR小鼠视网膜组织、DR患者玻璃体和房水标本中c MAP4K2和VEGFA表达增加,而组间mi R-377的表达未见显著改变。结论:1.多维度证实c MAP4K2与DR相关,提示c MAP4K2在DR的发生发展中可能扮演了重要角色,且c MAP4K2可能作为诊断DR的潜在生物标志物,辅助对DR患者的筛查。2.上（下）调c MAP4K2表达可增强（减弱）HRVECs的细胞活力、细胞增殖能力、细胞迁移和成管能力,加重（减轻）糖尿病小鼠视网膜血管渗漏,且与VEGFA及炎症因子的表达增加（减低）有关。提示c MAP4K2可作为防治DR的新靶点。3.c MAP4K2通过海绵样吸附下游靶基因mi R-377,从而阻止mi R-377与VEGFA m RNA的3’-UTR结合,使mi R-377对VEGFA表达的抑制作用减弱,最终导致VEGFA的表达增加。揭示了c MAP4K2通过调控mi R-377-VEGFA通路在DR中发挥作用的分子机制,丰富了DR发生机制的研究,为临床防治DR创新策略的建立开辟了新途径。