2019 年底新型冠状病毒肺炎（Corona Virus Disease 2019,COVID-19）在武汉爆发,尽管病毒在爆发初期被很好的遏制,但随着病毒在国外的扩散并迅速形成大流行,目前已经造成了全球多达4亿多例感染者,这对全球卫生系统和世界经济造成了巨大的影响。随着多株变异毒株的出现,抗SARS-CoV-2药物、中和抗体及疫苗的研发陷入了瓶颈。SARS-CoV-2棘突蛋白（Spike protein）是病毒负责入侵的重要蛋白,参与了病毒的受体识别、结合、融合和进入阶段,是抗病毒药物开发的重要靶点。跨膜亚基S2中的两个七肽重复序列HR1及HR2形成六螺旋束结构（Six-Helix Bundle,6-HB）参与了病毒与宿主细胞膜的融合和病毒基因的入胞。目前流行的变异毒株中,Spike蛋白S2亚基中的HR1及HR2较S1亚基中的RBD更加保守,以S2亚基中的HR1及HR2为靶点的药物更具广谱性。因此,本课题旨在研究一系列具有抗SARS-CoV-2活性的蛋白药物,并以此为基础建立快速药物筛选平台,筛选潜在抗病毒药物以及具有广谱中和活性的抗体,以应对目前流行的变异毒株和中和抗体耐药等问题。本课题根据SARS-CoV-2 Spike蛋白HR1及HR2序列,设计并表达了 5Helix、HR121及HR212蛋白,通过抗病毒实验及细胞融合抑制实验检验了蛋白的抗病毒活性,进一步利用圆二色谱仪、ELISA及荧光偏振等方法探明蛋白是通过抑制6-HB的形成而发挥抗病毒活性。利用表达的5Helix建立了基于荧光偏振的高通量药物筛选方法,筛选到具有抗SARS-CoV-2病毒活性的候选药物Thonningianin A,其能够抑制细胞融合,机制研究进一步发现其通过阻断六螺旋束的形成而发挥抗病毒活性。进一步利用表达的HR212及HR121蛋白免疫小鼠,检验了小鼠血清的抗体特征,发现小鼠血清中存在着可识别Spike蛋白及S2蛋白的抗体,同时小鼠血清也具备着抑制细胞融合的功能。通过与SP2/0细胞融合获得永生化的杂交瘤细胞,筛选鉴定得到来源于HR121的39株杂交瘤细胞及来源于HR212的23株杂交瘤细胞,这62株细胞培养上清中大部分在不同程度上抑制SARS-CoV-2 Delta假病毒的感染。最后,这批杂交瘤细胞亚克隆化后我们成功获得七个抗体,除3G1-1 mAb外,其他六个抗体均有中和活性,可识别不同突变体的SARS-CoV-2 Spike蛋白及SARS-CoV Spike蛋白,并与抗原紧密结合。其中2E3-12 mAb表现出强大的广谱中和活性及细胞融合抑制活性。通过基因鉴定得到其抗体可变区,与人抗体Fc融合而成的2E3-12-Fc抗体也具有相同的能力。进一步的抗体结合位点鉴定发现,2E3-12 mAb可与HR2P及S2-Fc结合,同时来源于SARS-CoV-2 HR2的HR2P可与HR212竞争2E3-12 mAb抗体上的结合位点,而来源于HR2的15-mer截短多肽则无竞争作用,表明该单抗结合表位可能是非线性的。此外,2E3-12 Fab与三聚体 Spike 蛋白（Spike protein for six stabilizing proline substitutions,S6P）结合后可改变S6P的构象,使S6P趋向于不稳定结构。综上所述,本课题成功开发了一系列抗SARS-CoV-2蛋白药物,并利用5Helix蛋白筛选得到同样具有抗SARS-CoV-2作用的小分子化合物Thonningianin A,利用HR121及HR212蛋白获得广谱中和抗体2E3-12,为遏制COVID-19的流行提供治疗新策略。