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1.研究背景骨肉瘤起源于间叶组织,具有侵袭能力强,起病隐匿,早期就发生肺转移及治疗后容易复发等临床特点,预后极差。近年来随着骨肉瘤诊断和治疗手段的更新,5年生存率有所改善。但仍无法充分了解骨肉瘤的复杂发病机制和无法有效解决远处转移及治疗后复发等难题,远期治疗效果仍达不到预期,临床疗效已趋于平台期。总之,仍需进一步探讨骨肉瘤增殖,侵袭及远处转移等分子机制。随着新一代生物技术的发展,目前发现真核生物转录组中存在大量非编码RNA,在基因表达调控过程中起着重要作用。miRNA可通过与靶基因的3’-UTR端相结合,调控癌细胞的增殖,凋亡,侵袭,自体吞噬,及远处转移等。目前研究成果表明,miRNA参与调控骨肉瘤的生物学行为。如miR-143-3p、miR-567和miR-302a等抑制骨肉瘤细胞侵袭及远处转移;而miR-27a和miR-411等促进骨肉瘤细胞的增殖。但是,miRNA影响骨肉瘤生物学行为的分子机制仍未完全确定,仍需进一步探讨。有研究表明miR-509-5p在结肠癌,肝癌及子宫颈癌等癌细胞中低表达,抑制癌细胞的生物学行为,提示miR-509-5p可能是人类恶性肿瘤的抑癌基因。2.目的基于以上背景,本研究通过发掘GEO等数据库,发现miR-509-5p与骨肉瘤患者的生存预后有密切联系。接下来将探讨其在骨肉瘤中的功能和发生作用的分子机制。3.研究方法和结果3.1第一部分通过TCGA、Target和GEO数据库,对骨肉瘤相关的miRNA进行差异性表达分析和生存预后分析,发现miR-509-5p在骨肉瘤中低表达并与骨肉瘤患者预后高度相关。进一步的研究发现,miR-509-5p在骨肉瘤组织及细胞中均显著低表达。通过构建过表达miR-509-5p慢病毒,转染后获取稳定高表达miR-509-5p的骨肉瘤细胞株。通过CCK-8实验,明确miR-509-5p如何影响骨肉瘤细胞的增殖能力;通过Transwell实验,明确miR-509-5p如何影响骨肉瘤细胞的侵袭能力;通过构建裸鼠成瘤模型,在体内水平明确miR-509-5p是否影响骨肉瘤细胞的生长。实验结果表明:miR-509-5p在骨肉瘤组织和细胞中低表达并与骨肉瘤患者预后密切相关;过表达miR-509-5p可抑制骨肉瘤细胞的增殖、侵袭,并抑制骨肉瘤细胞体内生长。3.2第二部分通过分析GEO,Targetscan和Target数据库,发现TRIB2可能是miR-509-5p的靶基因,在骨肉瘤中高表达并与骨肉瘤患者预后相关。进一步的研究发现,TRIB2在骨肉瘤组织及细胞中均显著高表达。通过构建沉默TRIB2慢病毒,转染获取稳定低表达TRIB2的骨肉瘤细胞株。通过CCK-8实验检测TRIB2是否对骨肉瘤细胞的增殖产生影响;通过Transwell实验检测TRIB2是否对骨肉瘤细胞的侵袭产生影响;通过细胞划痕检测TRIB2是否对骨肉瘤细胞迁移产生影响;通过构建裸鼠成瘤模型,检测TRIB2是否对骨肉瘤细胞体内生长产生影响。通过双荧光素酶实验验证miR-509-5p对TRIB2的靶向作用;通过Western Blot和qRT-PCR检测高表达miR-509-5p骨肉瘤细胞中的TRIB2表达量。实验结果表明:miR-509-5p靶向抑制TRIB2表达;TRIB2在骨肉瘤组织和细胞中高表达并与骨肉瘤预后密切相关;TRIB2作为miR-509-5p靶蛋白;抑制TRIB2的表达,可抑制骨肉瘤细胞的增殖、迁移和侵袭,并抑制骨肉瘤细胞体内生长。3.3第三部分通过生物信息学分析,发现TRIB2可与AP4发生蛋白相互作用。通过参考相关文献,AP4/p21通路可作为TRIB2的下游作用通路。采用免疫共沉淀实验验证TRIB2与AP4蛋白互作;通过双荧光素酶实验验证AP4通过与p21启动子结合,进而影响p21的表达。实验中设计对照组,过表达TRIB2组和过表达TRIB2+低表达AP4组,通过Western Blot的方法,验证TRIB2通过AP4影响p21的表达;通过CCK-8实验、Transwell实验、细胞划痕实验和凋亡实验,验证TRIB2通过AP4影响以上三组细胞的增殖、侵袭、迁移和凋亡变化。通过构建裸鼠成瘤模型,验证以上三组细胞体内成瘤生长变化,并通过Western Blot和免疫组织化学的方法,验证以上三组细胞体内成瘤后p21蛋白表达量变化。最后,设计对照组,过表达miR-509-5p组和过表达TRIB2+过表达miR-509-5p组,通过Western Blot的方法,验证miR-509-5p通过TRIB2影响影响AP4和p21的蛋白表达;通过Edu增殖实验和Transwell实验,验证miR-509-5p通过TRIB2影响以上三组细胞的增殖和侵袭能力变化。通过以上Rescue实验,表明TRIB2通过与AP4相互作用,抑制p21的表达,进而影响骨肉瘤细胞的增殖、迁移、侵袭及凋亡;同时,miR-509-5p通过TRIB2影响下游通路蛋白AP4和p21,进而影响骨肉瘤增殖、侵袭等生物学行为。4.结论4.1 miR-509-5p与骨肉瘤预后密切相关并抑制骨肉瘤细胞的增殖及侵袭。4.2 miR-509-5p通过靶向TRIB2抑制骨肉瘤细胞的增殖、迁移及侵袭。4.3 TRIB2通过与AP4的相互作用,在转录水平上抑制p21的表达,进而影响骨肉瘤细胞的生物学行为,包括增殖、迁移、侵袭及凋亡。4.4 miR-509-5p管控的TRIB2/AP4/p21通路可能是治疗骨肉瘤的新靶点。5.创新点5.1本研究结合生物信息学预测、数据库分析（GEO,Target,TCGA）与实验验证,从骨肉瘤患者样本、骨肉瘤细胞株以及裸鼠荷瘤模型三个层次上充分研究miR-509-5p在人体-细胞-动物模型中的作用及其作用机制。5.2本研究采用qTR-PCR、Western Blot、双荧光素酶、CO-IP、IHC等技术,揭示miRNA与靶蛋白,蛋白与蛋白之间的作用关系,明确miR-509-5p在转录调控及转录后调控的分子机制。5.3本研究首次明确miR-509-5p和TRIB2与骨肉瘤患者临床预后的关系;首次明确miR-509-5p和TRIB2对骨肉瘤细胞增殖、转移、侵袭和凋亡等调控作用;首次阐明miR-509-5p和TRIB2影响骨肉瘤细胞生物学行为的确切分子机制。