背景:二代测序是研究生物基因的一种技术,成本从最初的1美元1碱基逐步降低到各领域可以承受的范围,应用越来越广。结直肠癌（CRC）是最常见的恶性肿瘤之一。提高CRC和癌前息肉的早期筛查诊断率,对于及时治疗和改善预后至关重要。目前常用的高危人群初筛方法:结肠镜、大便潜血检测、CEA等肿瘤标志物各有局限。急需探寻可靠的无创性的生物标志分子用于早期CRC的诊断。DNA异常甲基化与CRC等肿瘤的发生发展密切相关。在CRC发生早期,癌症患者血浆中游离DNA甲基化水平普遍高于正常人,预示对DNA甲基化的检测将有可能成为用于结直肠息肉和结直肠癌诊断的二代标志分子。目的:（1）基于二代测序发掘结直肠癌患者组织和血浆中的DNA甲基化标志物,筛选外周血DNA甲基化标志物。（2）为了降低检测成本,建立基于多重PCR检测外周血DNA甲基化标志物用于结直肠癌无创早期诊断的技术平台。方法:（1）收集73例结直肠癌样本及配套癌旁样本和血浆样本,38例结直肠腺瘤和血浆样本,69例正常志愿者血细胞和血浆样本。分别提取组织和血浆DNA,流式芯片捕获,甲基化测序获取单碱基分辨率的数据。利用机器学习建立辨别模型,筛选出备选标记位点,并验证。按照p＜0.05和2倍以上差异过滤得到最终的DNA甲基化差异区域（DMR）,按照癌与良性的差异+癌与正常的差异-良性与正常的差异得到最后的DMR。（2）利用多重TaqMan实时荧光定量PCR检测方法检测外周血浆游离DNA甲基化差异,验证Septin9,AXL4和SDC2三位点诊断结直肠癌的准确性,并招募了来自5个中心的978名受试者进行这项检测。结果:（1）在CRC组织中发现315个有潜力的位点。特别是其中158个位点为CRC的区分,3位点组合提供了 6343种组合,提供了高达95%以上的准确性。在外周血浆中,发现15个DMR,有7个位于基因的启动子区间,癌的DMR均不在良性与正常组中出现,有很好的区分。良性与正常组间有9个DMR。（2）940人参与最终PCR体系的建立和性能评价试验。PCR系统的准确率为87.8%（95%CI 82.9%～91.5%）,灵敏度为 82.7%（95%CI 71.8%～90.1%）,特异性为90.1%（95%CI 84.3%～93.9%）。该方法对癌前病变的检出率达到55.0%（95%CI 38.7%～70.4%）。结论:1、结直肠癌DNA甲基化的标志位点组合丰富,3个差异甲基化位点可以很好的区别肿瘤;高甲基化基因HBX20具有抑癌作用,高甲基化可能抑制了 HBX20的抑癌功能;血浆中发现了 7个新的血源性甲基化标志物位点。2、建立了利用多重PCR检测血浆DNA甲基化三位点组合进行结直肠癌无创检测的平台,可以降低检测成本和验证成本。多重PCR设计工具Ultiplex可以协助多重引物设计。