Notch信号通路是一种在进化上高度保守的细胞内途径,在细胞周期调控、细胞增殖与凋亡中扮演着重要角色,其中转录抑制因子Su（H）（Suppressor of Hairless）作为Notch信号通路下游靶基因的分子开关发挥着独特的作用。近年来,基于昆虫Notch信号通路的研究十分活跃,家蚕（Bombyx mori）作为鳞翅目昆虫的重要模式,在其器官形成与发育过程中细胞周期形式既存在有丝分裂又有核内复制,但是Notch信号通路对家蚕细胞周期的调控作用尚不清楚。因此本研究以Notch信号通路和Bm Su（H）基因为切入点,探究其对家蚕细胞周期的影响,并解析其对细胞周期的调控机制。首先利用特异的信号通路抑制剂DAPT阻断Notch信号通路的激活,分析Notch信号通路对家蚕细胞有丝分裂以及丝腺核内复制的影响,并检测分子开关Bm Su（H）基因的表达变化,进而深入探究Bm Su（H）基因对家蚕细胞周期的影响及其调控网络,并构建Bm Su（H）丝腺特异敲除品系以探究其对家蚕丝腺核内复制的影响。本研究阐释了Notch信号通路和Bm Su（H）基因对家蚕细胞周期的作用,为完善细胞周期的调控机制提供新的理论支撑,也为家蚕丝腺的遗传改良提供了分子靶标。本研究的主要结果和结论如下:1.Notch信号通路在家蚕细胞周期中的功能分析为分析Notch信号通路对家蚕细胞周期的影响,在家蚕Bm N-SWU1细胞培养时添加特异性信号通路抑制剂DAPT来实现对Notch信号通路的阻断。首先,通过对细胞形态的观察和抑制剂效果的检测,筛选到浓度为60μmol/L和时间为48h的最佳抑制条件。随后,按所筛选的DAPT抑制条件处理细胞,通过CCK-8增殖活力检测发现抑制Notch信号通路会导致细胞增殖能力减弱。流式细胞术结果显示,添加抑制剂后将细胞周期阻滞在G2/M期,q RT-PCR和Western Blotting结果表明周期调控因子Bm Cyclin B的表达量无明显变化,但Bm CDK1的表达量显著升高。进一步在家蚕体内注射抑制剂后,通过Ed U标记技术对丝腺细胞进行分析,结果表明抑制Notch信号通路会促进丝腺细胞DNA的复制,q RT-PCR结果显示DNA复制相关周期因子Bm Cyclin A、Bm Cyclin E和Bm CDK2的表达量显著升高。同时,检测了Notch靶基因分子开关Bm Su（H）基因的表达,无论在细胞上还是在组织上抑制Notch信号通路,Bm Su（H）基因的表达量均明显降低,说明Notch信号通路对细胞周期的调控需要Bm Su（H）基因的参与。2.Bm Su（H）基因的克隆及表达特征分析为鉴定Bm Su（H）基因并探究其表达特征,结合NCBI数据库、家蚕基因组数据库Silk DB 3.0和Silk Base对Bm Su（H）基因的序列进行分析,通过基因克隆和序列特征分析发现,Bm Su（H）基因的CDS序列全长为1473bp,共编码490个氨基酸,预测蛋白量大小为54.99k Da。通过在线网站SMART对Bm Su（H）进行蛋白结构域预测,发现该蛋白包含LAG1和BTD两个结构域,它们具有典型的DNA结合位点,LAG1能与靶基因启动子序列结合从而激活或者抑制表达,BTD是Bm Su（H）基因与胞内结构域NICD的结合位点。利用Clustalx1.83软件进行多物种序列比对发现Bm Su（H）蛋白的两个功能结构域在不同昆虫中都高度保守。通过MEGA6.0软件构建系统进化树分析发现脊椎动物的同源蛋白聚在一支,无脊椎动物聚为另一支,Bm Su（H）蛋白与鳞翅目昆虫的同源蛋白聚为一支,且与烟草天蛾亲缘性最相近,表明它们在进化关系上更密切。通过分析Bm Su（H）基因在家蚕不同时期丝腺组织中的表达,发现该基因在胚胎丝腺有丝分裂和转换期高表达,在核内复制时期低表达;在幼虫阶段,Bm Su（H）基因在盛食期的丝腺中低表达,在蜕皮期的丝腺中高表达。最后通过网站预测Bm Su（H）蛋白在180aa-182aa处存在核定位信号,免疫荧光分析也证实该蛋白定位于细胞核中。3.Bm Su（H）基因的功能及调控机制分析为研究Bm Su（H）基因在家蚕细胞周期中的功能,构建了Bm Su（H）基因的过表达载体和敲除载体,并检测了过表达和敲除效率。在Bm N-SWU1细胞中过表达或敲除Bm Su（H）基因后,通过CCK-8增殖活力检测、Ed U标记、流式细胞术、q RT-PCR和Western Blotting等实验方法分析细胞周期的变化,结果表明过表达Bm Su（H）基因抑制细胞的增殖复制,将细胞周期阻滞在G1期,上调G1期的周期调控因子Bm Cyclin D和Bm CDK4在转录水平上的表达,下调S期的周期调控因子Bm Cyclin A和Bm CDK2在转录水平和蛋白水平上的表达;敲除Bm Su（H）基因后促进细胞增殖和DNA复制,将细胞周期阻滞在S期,并且S期的周期调控因子Bm Cyclin A和Bm CDK2的表达量在转录水平和蛋白水平上都显著升高。进一步,对Bm Su（H）蛋白作为转录因子的调控机制进行了探究。在JASPAR网站预测到Bm Cyclin A、Bm Cyclin E和Bm CDK1基因的上游启动子区域有Bm Su（H）蛋白的结合位点;双荧光素酶报告系统结果表明Bm Su（H）会降低Bm Cyclin A和Bm Cyclin E基因的启动子活性,升高Bm CDK1基因的启动子活性。通过q RT-PCR检测证明了Bm Su（H）对Bm Cyclin A和Bm Cyclin E基因具有转录抑制的作用,对Bm CDK1基因有转录促进作用。结合以上结果推测Bm Su（H）蛋白可以通过对细胞周期因子的转录调控来影响细胞周期,其调控网络可能分为两条途径,一是调控Bm Cyclin A和Bm Cyclin E基因的表达,影响S期的循环进行;二是调控Bm CDK1基因的表达,控制细胞周期进入M期的速度。4.Bm Su（H）丝腺特异敲除品系的创制及分析为研究Bm Su（H）基因对家蚕丝腺细胞核内复制的影响,构建了Bm Su（H）丝腺特异敲除品系,检测敲除效率可达70%。通过对蚕茧大小、茧层重、茧层率的观察与统计,发现在丝腺中敲除Bm Su（H）基因后,蚕茧明显变大,茧层重和茧层率均显著高于对照品系。通过扫描电镜观察蚕茧表面和蚕茧内面,发现敲除品系蚕茧表面的茧丝排布明显比对照品系紊乱。对敲除品系五龄的丝腺组织进行表型观察发现,到五龄第三天时,敲除品系的中部丝腺明显变长变重,前部与后部丝腺则无显著区别。通过对丝腺细胞进行Ed U标记,发现在丝腺中特异敲除Bm Su（H）基因后,能促进丝腺DNA的复制,提高核内复制效率。通过q RT-PCR检测敲除品系中靶基因的表达,发现靶基因的变化情况与在细胞水平上敲除Bm Su（H）基因的结果一致。