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胃癌是比较常见的恶性肿瘤,因其具有反复发作、易转移、耐药性强等特点严重威胁着人民的生命健康,全世界每年有近一百万例新胃癌病例,发病率及病死率高居世界第四、我国恶性肿瘤第二、消化系统恶性肿瘤首位。依据胃癌病灶的浸润程度和传播深度的不同,胃癌可被分级为早期胃癌和进展期胃癌。若非提早诊断,早期胃癌没有明显的特异性临床症状和特征,所以导致大部分胃癌患者就诊时属于晚期胃癌,其预后情况并不良好。随着人们健康意识的提升和早期诊断意识的增加,早期胃癌病例呈现增加的趋势。目前大部分的早期胃癌患者可通过手术根治,而进展期患者则以临床手术的治疗为主,进行综合治疗。细胞增殖作为维持细胞遗传信息的传递以及生命活动正常进行的关键步骤,是生物体的一个重要生命特征。在正常条件下,真核生物通过三种方式（有丝分裂、无丝分裂和减数分裂）来进行细胞分裂,从而进行细胞增殖。在这个过程中,由于外部环境以及内部因子的影响,人类细胞无时无刻不面对着细胞DNA复制的不确定性,这种不确定使细胞面临着DNA损伤的发生。人体为了对抗DNA损伤对细胞带来的负面影响,进化出各种复杂且高度特异性的DNA损伤修复机制对细胞进行修复。而当这种损伤严重或DNA损伤累积至一定程度,DNA损伤无法被修复,细胞就会启动程序性死亡,清除掉出现问题的细胞。所以,探究影响癌细胞增殖的关键因子以及研究DNA损伤修复及凋亡的关键信号通路是至关重要的。E3泛素蛋白连接酶ARIH2（TRIAD1）是一种Ariadne亚家族连接酶,参与蛋白酶体降解相关蛋白的多泛素化过程。ARIH2核蛋白包含一个氨基末端酸性结构域、一对RING结构、两个羧基末端螺旋圈结构域以及一个位于RING结构之间的新的C6HC DRIL/IBR结构域。成对的RING结构与DRIL/IBR结构域一起形成一个高度保守的TRIAD（两个RING结构与DRIL）结构域。近年的研究表明,在脑出血中,抑制ARIH2的表达可能可以保护大脑免受脑出血后的继发性损伤;ARIH2还影响融合基因mll-ell诱导的急性髓系白血病的发生,激活ARIH2,或由ARIH2底物调控的靶向途径,是治疗过表达急性髓系白血病的潜在方法。有研究报道ARIH2是11q-23急性髓系白血病的抑制因子,表明ARIH2可能是急性髓系白血病新的治疗靶点;除此之外,ARIH2在许多髓细胞系以及癌细胞系中被研究出与细胞凋亡有关。到目前为止,ARIH2在胃癌细胞增殖能力中所起的作用未有所探究。本文着眼于检测ARIH2对胃癌细胞增殖能力的影响,并通过探究ARIH2对p21表达的调控机制,为探索胃癌的发病机制和将ARIH2作为潜在的治疗靶点提供一些见解。本文的主要实验结果如下:1.ARIH2在胃癌组织中高表达,并且ARIH2高表达与病人预后情况差相关。我们首先通过R2数据库发现了ARIH2高表达量与病人预后情况差相关,并且ARIH2表达量在胃癌组织中相对于正常组织显著增高;随后通过免疫印迹实验,我们检测到ARIH2在各胃癌细胞系中均有表达;免疫组化染色实验显示ARIH2在胃癌组织中较正常胃组织显著高表达,并且其在细胞核和细胞质中均有表达,而主要表达在细胞核中。以上实验证明ARIH2在胃癌组织中高表达,其高表达与胃癌病人预后情况差相关。2.ARIH2促进胃癌细胞的增殖能力。为了探究ARIH2对胃癌细胞增殖所起的作用,我们首先设计了ARIH2的干涉引物,并通过慢病毒感染技术在胃癌细胞系MKN45和SGC7901中下调ARIH2的表达。通过显微镜观察,我们发现下调ARIH2表达后,胃癌细胞的形态发生明显的改变。我们做了细胞增殖分析、Brd U和平板克隆实验等细胞增殖能力检测实验,发现下调ARIH2能够显著抑制胃癌细胞的增殖能力。我们进一步使用流式细胞分析术检测,实验结果显示下调ARIH2表达使胃癌细胞的周期进程显著阻滞在G2/M期。随后我们便检测了G2/M期相关的周期蛋白,发现下调ARIH2后,p21和p27的蛋白表达水平上调,CDK1和CDK2的蛋白表达水平显著下调。为了进一步证实ARIH2的下调对G2/M期相关蛋白的影响作用,我们同样进行了过表达实验。我们在过表达ARIH2后使用细胞增殖分析以及Brd U实验证实了胃癌细胞的增殖情况得到提升,并且发现G2/M期相关蛋白p21和p27的蛋白表达量下调,而CDK1和CDK2的蛋白表达量上调。以上实验证明ARIH2能够促进胃癌细胞的增殖能力,并且通过影响细胞周期进程来调控胃癌细胞的增殖能力。3.敲低ARIH2显著抑制胃癌细胞在体内外的成瘤能力。为了进一步探究敲低ARIH2对胃癌细胞体外克隆形成能力中是否会有显著影响,soft agar实验首先被进行。结果显示敲低ARIH2后,软琼脂中胃癌细胞所形成的集落的体积显著变小,并且数目也显著减少。为了探究敲低ARIH2对胃癌细胞的体内成瘤能力是否有影响,我们也进行了小鼠皮下注射胃癌细胞成瘤实验,结果表明,敲低ARIH2后胃癌细胞在小鼠体内形成肿瘤的大小和重量显著下降,显示胃癌细胞的体内成瘤能力受到显著抑制。进一步的免疫组化实验结果显示,敲低ARIH2后小鼠肿瘤切片上Ki67的阳性率被观察到显著下降,证明敲低ARIH2能够通过抑制胃癌细胞的增殖能力,来影响胃癌细胞在体内外的克隆形成能力和成瘤能力。4.ARIH2与p21相互作用,并通过泛素化p21来调节其表达。鉴于p21的已知细胞特征可被E3连接酶泛素化而快速降解,而ARIH2是一种E3连接酶,我们探究了ARIH2与p21之间是否存在蛋白互作关系。首先通过免疫共沉淀实验,我们在293FT细胞与SGC7901细胞中均发现ARIH2与p21相互共沉淀。在胃癌细胞中过表达ARIH2后添加MG132蛋白酶抑制剂后,结果显示,过表达ARIH2导致p21表达显著下调,而添加MG132后p21水平显著上调,证明ARIH2在转录后水平调节p21。随后的CHX放线菌酮添加实验表明ARIH2下调会显著延长p21的半衰期,说明ARIH2可以调节p21的稳定性。为了进一步探究ARIH2调节p21稳定性的机制,我们通过免疫共沉淀实验探究出ARIH2过表达后p21的泛素化水平增加。通过体外泛素化实验,我们证明了ARIH2直接泛素化p21且ARIH2是p21的E3连接酶。我们还构建了突变了泛素分子和p21上关键赖氨酸位点的载体,再进行免疫共沉淀实验,探究出发挥关键作用的赖氨酸是泛素分子的K48位点和p21的K161位点。5.在下调ARIH2的胃癌细胞中下调p21部分恢复了ARIH2敲低诱导的增殖抑制。接下来,我们在下调ARIH2的MKN45和SGC7901细胞中下调p21,检查其对胃癌细胞增殖的影响。我们通过一系列的细胞增殖能力检测实验检测了胃癌细胞的增殖能力,发现双干涉有效恢复了下调ARIH2所带来的生长抑制。接着,我们进行了皮下异种移植实验,结果表明双干涉后肿瘤的大小和重量均显著恢复。上述实验结果表明,ARIH2通过调节p21蛋白的表达水平,来调节胃癌细胞的增殖能力。6.ARIH2下调诱导胃癌细胞发生DNA损伤,并提高胃癌细胞的化疗敏感性。为了探究下调ARIH2是否诱导了胃癌细胞的DNA损伤,我们进行了免疫荧光实验检测单细胞中γ-H2AX信号,以及细胞彗星拖尾实验,并且检测了DNA损伤相关蛋白。结果发现下调ARIH2后胃癌细胞的DNA损伤水平显著上调。然后我们在下调ARIH2的胃癌细胞中添加五氟尿嘧啶,发现下调ARIH2可以进一步提高五氟尿嘧啶诱导的细胞凋亡水平。接着我们在小鼠体内进行皮下注射干涉ARIH2的胃癌细胞后联合五氟尿嘧啶治疗,发现下调ARIH2联合五氟尿嘧啶处理可以进一步增强胃癌细胞的化疗敏感性。综上所述,本文的实验结果表明ARIH2能够促进胃癌细胞的增殖能力,并且ARIH2与p21存在蛋白直接互作关系,ARIH2通过泛素化来调节p21的稳定性,从而调节胃癌细胞的增殖能力。除此之外,ARIH2下调诱导了胃癌细胞的DNA损伤,并且调节胃癌细胞的化疗敏感性。本研究着眼于探究ARIH2对胃癌细胞增殖能力的影响以及与p21之间的调控关系,以期更好探究出胃癌的发生发展机制与分子机理,并为寻找胃癌的靶向治疗策略提供一些见解。