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醒脑静是一种具有开窍醒脑、凉血行气、活血化瘀、清热解毒等功效的中药注射剂,常用于治疗脑出血、脑梗塞、颅脑外伤、中风、中枢神经系统感染引起的意识障碍等急性脑血管疾病。醒脑静可以使大脑恢复敏锐并迅速引起意识,广泛用于脑出血(ICH)的急性期。虽然醒脑静疗效确切,在临床上广泛应用,但是由于其给药剂型为注射剂型,且临床应用中表现出多种副作用,因此醒脑静注射剂的临床安全性受到了大家的广泛重视。雾化吸入剂是一种相对安全的新的给药形式,该给药方式可大大减轻注射给药的副作用,呼吸道功能的维持离不开水和黏液的适量分泌,所以理想的雾化给药制剂不应对气道黏液清除功能产生影响。因此本研究在多种上皮细胞上,运用细胞荧光功能模型、短路电流技术以及高效液相HPLC技术系统分析醒脑静及其活性成分对多种气道液体分泌相关氯离子通道的影响,以判断将醒脑静开发成雾化吸入制剂的可行性,实验结果如下:1.利用FRT/TMEM16A/YFP-H148Q/I152L功能测定模型检测到醒脑静能够以剂量依赖的方式抑制TMEM16A通道活性,IC50值约为23.37 μg/mL。2.在FRT-TMEM16A细胞上进行的短路电流实验分析结果显示醒脑静能够在FRT-TMEM16A细胞顶膜侧抑制TMEM16A介导的电流,IC50值约为19.65 μg/mL。3.利用FRT/CFTR/YFP-H148Q/I152L功能测定模型检测到醒脑静能够以剂量依赖的方式抑制CFTR通道活性,IC50值约为40.06 μg/mL。4.在FRT-CFTR细胞上进行的短路电流实验分析结果显示醒脑静能够在FRT-CFTR细胞顶膜侧抑制CFTR介导的电流,在134 μg/mL时达到69.56%抑制率。5.HPLC的分析结果显示醒脑静中莪术酮、莪术二酮、吉马酮的浓度分别为1.09 μM(莪术酮)、8.23 μM(莪术二酮)、3.1 μM(吉马酮),莪术呋喃二烯酮,莪术醇含量极低。6.利用FRT/TMEM16A/YFP-H148Q/I152L功能测定模型检测到莪术酮、吉马酮、莪术呋喃二烯酮、莪术醇及莪术二酮能够以剂量依赖的方式抑制TMEM16A通道活性,IC50值分别约为87.96 μM(莪术酮)、15.12 μM(吉马酮)、23.35 μM(莪术呋喃二烯酮)、50.55 μM(莪术醇)、44.00 μM(莪术二酮)。7.在FRT-TMEM16A细胞上进行的短路电流实验结果显示倍半萜类化合物能够在FRT-TMEM16A细胞顶膜侧抑制TMEM16A介导的电流,IC50值分别约为16.32 μM(莪术酮)、11.45 μM(吉马酮)、9.88 μM(莪术呋喃二烯酮)、30.58 μM(莪术醇)及38.62 μM(莪术二酮)。5种倍半萜类化合物对TMEM16A钙激活氯离子通道活性均具有快速抑制的特点,其中莪术二酮、莪术醇、莪术呋喃二烯酮抑制效果不可逆,莪术酮、吉马酮抑制效果可逆。8.对CFTR的测定结果显示倍半萜类化合物对CFTR通道活性具有抑制作用,其中莪术酮、吉马酮分在20 μM时能够完全抑制氯离子电流,莪术醇在200 μM时能够完全抑制氯离子电流,莪术二酮,莪术呋喃二烯酮在20 μM时抑制率分别达到83.78%和91.67%。组织上的短路电流结果显示倍半萜类化合物对CFTR氯离子通道无抑制作用。9.HBE细胞上的短路电流测定结果显示五种倍半萜类化合物均能够抑制由UTP产生的电流,抑制率分别为65.12%(莪术酮)、91.16%(吉马酮)、79.07%(莪术呋喃二烯酮)、76.74%(莪术醇)、67.44%(莪术二酮)。其中吉马酮的抑制效果最为明显,和阳性对照CaCCinh-A01(90.69%)抑制效果相当。10.Ca2+浓度测定结果显示除莪术二酮外,倍半萜类化合物能够抑制由ATP引起的细胞内钙离子浓度升高,说明莪术酮、吉马酮、莪术呋喃二烯酮、莪术醇能够通过抑制细胞内的钙离子浓度来抑制CaCC氯离子通道活性。11.对CaCC作用的测定结果显示,五种化合物均能抑制由ATP激起的CaCC电流,最大抑制浓度分别为:50 μM(莪术酮)、50 μM(吉马酮)、50 μM(莪术呋喃二烯酮)、100 μM(莪术醇)、200 μM(莪术二酮)。12.组织上五种倍半萜类化合物通过孵育后对由cch激起的电流有抑制作用,50 μM和100 μM的莪术酮分别抑制了 48.21%和67.89%的电流,50 μM和100 μM的吉马酮分别抑制了 26.65%和41.44%的电流,50 μM和100 μM的莪术呋喃二烯酮分别抑制了14.24%和34.89%的电流,100 μM和200 μM的莪术醇分别抑制了 22.40%和33.78%的电流,100 μM和200 μM的莪术二酮分别抑制了 11.65%和30.72%的电流,且50 μM和100 μM的莪术酮的抑制效果优于CaCCinh-A01的抑制效果。13.对Na+-K+-ATPase通道的测定结果显示五种倍半萜类化合物对小鼠结肠上皮浆膜侧Na+-K+-ATPase没有抑制作用。14.对K+通道的测定结果显示100 μM时五种倍半萜类化合物对K+通道活性有抑制作用,抑制率分别为72.66%(莪术酮)、10.18%(吉马酮)、19.69%(莪术呋喃二烯酮)、41.58%(莪术醇)、20.27%(莪术二酮),其中莪术酮的抑制效果最为显著。综上所述,醒脑静及其中的活性成分在低浓度条件下对TMEM16A、CFTR和CaCC氯离子通道活性无抑制作用,提示对水和黏液的转运没有显著的影响,雾化给药方案可行。高浓度的醒脑静对TMEM16A和CFTR氯离子通道活性有抑制作用,且高浓度时活性化合物能够降低细胞内Ca2+浓度,抑制钾通道活性,因此注意大剂量使用该药物,或长期给药所造成的药物累积仍可造成副作用的产生。