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肺结核(TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacteria tuberculosis, Mtb)引起的一种严重威胁人类健康的慢性传染病,世卫组织《2013年全球结核病报告》中表明2012年结核病病人数为860万人,全球结核病死亡数130万,尽管感染人数和死亡人数均呈现缓慢下降趋势,但仍面临着结核分枝杆菌产生耐药性的危机。同时,抗结核药物研发进展的缓慢更加剧了结核防治任务的艰巨性。因此,开发针对新颖靶点的抗结核药物已经迫在眉睫。结核分枝杆菌中存在11种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶PknA-PknL (STPKs)[1],其中PknB广泛参与到了有关结核分枝杆菌生长繁殖的信号转导途径,在结核分枝杆菌生长分裂和细胞形态的调节中发挥着重要作用,为结核分枝杆菌生存所必需,可作为抗结核药物的筛选靶点之一本研究表达纯化了PknB的N端激酶结构域蛋白,并以其为靶标建立并优化了适用于微生物发酵液样品筛选的、以NADH比色法为基础的PknB抑制剂高通量筛选模型,此模型与本实验室已经建立的以萤光素酶法为基础的PknB抑制剂筛选模型相比,最大的优点在于反应体系在最后的结果检测中不受样品颜色的干扰,可用于筛选颜色较深的发酵液样品。本研究利用该模型筛选了20000个发酵液样品,得到阳性发酵液样品56个,其中5株阳性菌株I10A-00359、I10A-00827、I11A-01925、I11A-02040、I11A-02296的发酵液样品对结核分枝杆菌PknB酶活和耻垢分枝杆菌、海分枝杆菌、结核分枝杆菌的生长均具有抑制作用。其中,阳性样品I10AA-00359、I11AA-01925和I11AA-02296具有较低的细胞毒性。本研究为考察这五个阳性样品的酶活抑制选择性,表达了结核分枝杆菌PknH、PknF和人的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶AKT-1,分别建立和优化了各蛋白的酶活测定方法。结合实验室原有的工作,初步建立了结核分枝杆菌丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶酶活抑制特异性的评价体系。研究结果发现样品I10AA-00359、I10AA-00827, I11AA-02040和I11AA-02296的酶活抑制选择性较好。最后,本研究对5个阳性发酵液样品进行了初步的分离,并对分离后各部份进行了抑酶、抗菌活性的测定和细胞毒性及酶活抑制选择性的评价。结果显示,I11A-02040菌株发酵液上清和菌丝体甲醇抽提后正丁醇萃取部份(D、H)以及I10A-00827菌株发酵液上清正丁醇萃取部份(D)具有良好的抑酶、抗菌活性,并具有较小的细胞毒性和较好的酶活抑制选择性,为后续活性物质的分离纯化奠定了初步的基础。