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水生呼肠孤病毒（Aquareovirusgenus，Reoviridae）是危害鱼类健康的重要病原之一，其中草鱼呼肠孤病毒（AquqreovirusC/Grasscarpreovirus，GCRV）是草鱼（Ctenopharyngodonidellus）出血病的致病病原，GCRV为非囊膜分节段双链RNA（dsRNA）病毒。近几十年来从草鱼中先后分离鉴定出3种GCRV基因型（代表病毒株：I型，GCRV-873；II型，GCRV-HZ08；III型，GCRV-104）。GCRVI型基因组(GCRVTypleI)是由11条分节段（基因组片段）的dsRNA构成，一直公认其编码12个蛋白；其中Segment7（S7）节段的上游编码一个膜融合蛋白（Membranefusionprotein）NS16，下游编码一个功能未知的蛋白NS31。本研究主要阐述I型GCRV-S7编码特性（三顺反子）及其编码蛋白NS31与宿主细胞热休克效应的相互关系(NS31转录调控HSP70表达)。主要研究内容如下：
1．GCRV-S7是病毒的一个三顺反子（Tricistron）
病毒核酸序列分析发现在GCRV-JX01-S7中，除了NS16和NS31的编码阅读框（Openreadingframe，ORF）之外，还有第三个阅读框的存在（195-518nt），其编码一个预测大小为11.93kDa的蛋白（107aa），暂命名为NS12；通过RT-PCR，免疫印迹，间接免疫荧光以及串联质谱等一系列实验证明NS12并不是一个假性基因（Pseudogene），其在病毒复制过程中有效表达；通过表达动态分析发现NS12在病毒感染中后期表达。蛋白氨基酸序列分析发现NS12与NS16一样，也含有一个保守的跨膜结构域；膜蛋白组份分离实验说明NS12的确是一个膜相关蛋白，但NS12蛋白膜融合诱导实验说明NS12并不能够直接诱导宿主细胞的合胞体形成（膜融合）。同样在其它水生呼肠孤病毒属（Aquareovirus-A，B，G）的11株病毒中也发现NS12同源蛋白，说明NS12相似蛋白在Aquareovirus属中广泛存在（通过ATG或非ATG起始位点翻译），在病毒感染过程中行使保守功能。以上结果说明GCRV-S7节段编码3个蛋白，是呼肠孤病毒中一个新鉴定的三顺反子，推测S7通过leaky-scanning和ribosome-shunting机制分别翻译下游编码蛋白（NS12和NS31）。
2．在酵母中鉴定NS31的转录活性
在分析S7节段编码特性基础上，进一步探索其编码蛋白NS31的功能：利用层析方法纯化GCRV-JX01病毒粒子，原核表达纯化NS31蛋白用于制备多克隆抗体，利用免疫印迹实验证实NS31是病毒编码的非结构蛋白，其在病毒感染的中期开始表达，这与外衣壳蛋白VP7和VP5表达基本一致；利用酵母报告系统分析发现NS31是唯一一个GCRV编码具有转录活性的蛋白（Transcription Activator）；在酵母中融合蛋白NS31-BD的强转录活性依赖于其全长的完整性，NS31蛋白的N-端和C-端与BD融合具有微弱的转录活性，并且NS31中段（131-214aa）调控（抑制）其自身转录功能，这一过程可能与其亚细胞定位特性有关；并且NS31-BD在酵母中活化报告基因的转录依赖于BD结构域。我们可推测NS31-BD融合蛋白通过BD结构域直接靶向报告基因启动子，从而NS31像Gal4-AD一样在酵母中活化报告基因的转录。由于GCRV是dsRNA病毒，其在细胞质内复制装配，其自身的基因组复制并没有转录的步骤（DNA转录为RNA），故推断NS31可能是参与宿主基因转录的调控因子。
3．NS31选择性转录调控宿主细胞热休克蛋白（Heatshockproteins，HSPs）表达
在酵母中NS31展现出转录调控功能，进一步寻找NS31的可能性转录靶标：通过转录组测序结果分析发现NS31在CIK细胞中过表达能够上调HSP70mRNA水平，同时病毒感染12h和20h也能上调HSP70mRNA水平；进一步制备特异性识别草鱼HSP70蛋白多克隆抗体，定量RT-PCR和免疫印迹实验表明：在未感染GCRV鱼类细胞中HSP70表达极低，难以检测到；在NS31过表达或病毒感染的细胞（CIK和GCO）中，HSP70基因上调表达（转录及蛋白水平），并且GCRV感染细胞后检测到HSP70蛋白表达随着NS31表达逐渐升高；进一步对HSPs家族基因（HSP30，HSP90，HSC70和HSF1等）表达分析发现NS31选择性调控HSPs表达（仅有效诱导HSP70表达）。克隆HSP70基因上游启动子区（2000bp左右），应用双荧光素酶报告系统证明NS31特异性调控HSP70启动子表达；对NS31截断体功能分析发现其C-端（1-74aa）和N-端（214-274aa）可能是调控HSP70表达的功能区域。依据本部分结果推测GCRV病毒通过NS31转录调控诱导宿主HSP70表达。
4．NS31转录调控HSP70机制及其对病毒感染效率的影响
本部分首先应用双荧光素酶报告系统鉴定NS31转录活化HSP70基因的核心启动子，发现HSP70翻译起始位点上游-791/-429序列是NS31活化的必需位点；同时利用EMSA实验阐明NS31（杆状病毒表达系统表达NS31蛋白）与HSP70核心启动子并不能够体外直接结合；推测NS31可能通过与HSP70调控蛋白结合行使转录功能。利用pull-down联合质谱鉴定与NS31相互作用的宿主蛋白，其中发现NS31能够与共转录因子p300相互作用；进一步发现利用p300抑制剂或shRNA干扰技术敲降p300能够抑制GCRV感染或NS31表达对HSP70表达的诱导作用，说明NS31调控HSP70转录依赖于p300共转录因子。最后利用HSP70抑制剂或HSP70过表达评估HSP70表达丰度对GCRV感染效率的影响，发现HSP70能够促进GCRV感染，其可能成为抗病毒靶标的潜在因子。
1．GCRV-S7是病毒的一个三顺反子（Tricistron）
病毒核酸序列分析发现在GCRV-JX01-S7中，除了NS16和NS31的编码阅读框（Openreadingframe，ORF）之外，还有第三个阅读框的存在（195-518nt），其编码一个预测大小为11.93kDa的蛋白（107aa），暂命名为NS12；通过RT-PCR，免疫印迹，间接免疫荧光以及串联质谱等一系列实验证明NS12并不是一个假性基因（Pseudogene），其在病毒复制过程中有效表达；通过表达动态分析发现NS12在病毒感染中后期表达。蛋白氨基酸序列分析发现NS12与NS16一样，也含有一个保守的跨膜结构域；膜蛋白组份分离实验说明NS12的确是一个膜相关蛋白，但NS12蛋白膜融合诱导实验说明NS12并不能够直接诱导宿主细胞的合胞体形成（膜融合）。同样在其它水生呼肠孤病毒属（Aquareovirus-A，B，G）的11株病毒中也发现NS12同源蛋白，说明NS12相似蛋白在Aquareovirus属中广泛存在（通过ATG或非ATG起始位点翻译），在病毒感染过程中行使保守功能。以上结果说明GCRV-S7节段编码3个蛋白，是呼肠孤病毒中一个新鉴定的三顺反子，推测S7通过leaky-scanning和ribosome-shunting机制分别翻译下游编码蛋白（NS12和NS31）。
2．在酵母中鉴定NS31的转录活性
在分析S7节段编码特性基础上，进一步探索其编码蛋白NS31的功能：利用层析方法纯化GCRV-JX01病毒粒子，原核表达纯化NS31蛋白用于制备多克隆抗体，利用免疫印迹实验证实NS31是病毒编码的非结构蛋白，其在病毒感染的中期开始表达，这与外衣壳蛋白VP7和VP5表达基本一致；利用酵母报告系统分析发现NS31是唯一一个GCRV编码具有转录活性的蛋白（Transcription Activator）；在酵母中融合蛋白NS31-BD的强转录活性依赖于其全长的完整性，NS31蛋白的N-端和C-端与BD融合具有微弱的转录活性，并且NS31中段（131-214aa）调控（抑制）其自身转录功能，这一过程可能与其亚细胞定位特性有关；并且NS31-BD在酵母中活化报告基因的转录依赖于BD结构域。我们可推测NS31-BD融合蛋白通过BD结构域直接靶向报告基因启动子，从而NS31像Gal4-AD一样在酵母中活化报告基因的转录。由于GCRV是dsRNA病毒，其在细胞质内复制装配，其自身的基因组复制并没有转录的步骤（DNA转录为RNA），故推断NS31可能是参与宿主基因转录的调控因子。
3．NS31选择性转录调控宿主细胞热休克蛋白（Heatshockproteins，HSPs）表达
在酵母中NS31展现出转录调控功能，进一步寻找NS31的可能性转录靶标：通过转录组测序结果分析发现NS31在CIK细胞中过表达能够上调HSP70mRNA水平，同时病毒感染12h和20h也能上调HSP70mRNA水平；进一步制备特异性识别草鱼HSP70蛋白多克隆抗体，定量RT-PCR和免疫印迹实验表明：在未感染GCRV鱼类细胞中HSP70表达极低，难以检测到；在NS31过表达或病毒感染的细胞（CIK和GCO）中，HSP70基因上调表达（转录及蛋白水平），并且GCRV感染细胞后检测到HSP70蛋白表达随着NS31表达逐渐升高；进一步对HSPs家族基因（HSP30，HSP90，HSC70和HSF1等）表达分析发现NS31选择性调控HSPs表达（仅有效诱导HSP70表达）。克隆HSP70基因上游启动子区（2000bp左右），应用双荧光素酶报告系统证明NS31特异性调控HSP70启动子表达；对NS31截断体功能分析发现其C-端（1-74aa）和N-端（214-274aa）可能是调控HSP70表达的功能区域。依据本部分结果推测GCRV病毒通过NS31转录调控诱导宿主HSP70表达。
4．NS31转录调控HSP70机制及其对病毒感染效率的影响
本部分首先应用双荧光素酶报告系统鉴定NS31转录活化HSP70基因的核心启动子，发现HSP70翻译起始位点上游-791/-429序列是NS31活化的必需位点；同时利用EMSA实验阐明NS31（杆状病毒表达系统表达NS31蛋白）与HSP70核心启动子并不能够体外直接结合；推测NS31可能通过与HSP70调控蛋白结合行使转录功能。利用pull-down联合质谱鉴定与NS31相互作用的宿主蛋白，其中发现NS31能够与共转录因子p300相互作用；进一步发现利用p300抑制剂或shRNA干扰技术敲降p300能够抑制GCRV感染或NS31表达对HSP70表达的诱导作用，说明NS31调控HSP70转录依赖于p300共转录因子。最后利用HSP70抑制剂或HSP70过表达评估HSP70表达丰度对GCRV感染效率的影响，发现HSP70能够促进GCRV感染，其可能成为抗病毒靶标的潜在因子。