【摘 要】
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背景星形孢菌素(staurosporine,STS)是从微生物中获得的具有抗真菌作用的生物碱,能够抑制血小板凝集和多种蛋白激酶的活性。作为一种常见的细胞凋亡诱导剂,STS常用于研究多巴胺能神经元细胞的凋亡。异欧前胡素(isoimperatorin,ISO)属于呋喃香豆素类化合物,是白芷、羌活、北沙参等多种中药的有效成分,具有抗癌、镇痛、抑制炎症的作用。最新研究发现,异欧前胡素能够抑制神经细胞氧化应
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背景星形孢菌素(staurosporine,STS)是从微生物中获得的具有抗真菌作用的生物碱,能够抑制血小板凝集和多种蛋白激酶的活性。作为一种常见的细胞凋亡诱导剂,STS常用于研究多巴胺能神经元细胞的凋亡。异欧前胡素(isoimperatorin,ISO)属于呋喃香豆素类化合物,是白芷、羌活、北沙参等多种中药的有效成分,具有抗癌、镇痛、抑制炎症的作用。最新研究发现,异欧前胡素能够抑制神经细胞氧化应激反应和细胞凋亡。然而,异欧前胡素对STS诱导的神经细胞凋亡是否有保护作用,及其机制并不清楚。目的1.探究异欧前胡素对STS诱导的神经细胞毒性的保护效果;2.阐明异欧前胡素对神经细胞凋亡保护的分子机制。方法1.检测异欧前胡素对神经母瘤细胞SH-SY5Y细胞活力的影响使用不同浓度的异欧前胡素处理SH-SY5Y细胞后,利用CCK-8法检测不同浓度的异欧前胡素处理神经细胞24 h后对细胞活力的影响。2.探究异欧前胡素对STS诱导的SH-SY5Y细胞凋亡的影响使用异欧前胡素提前处理SH-SY5Y细胞24 h,随后在细胞培养基中加入STS继续培养4 h诱导细胞凋亡,使用CCK-8法检测细胞存活力,Western blot技术检测凋亡标志物蛋白cleaved PARP、Bad以及抗凋亡蛋白Bcl-2的蛋白表达水平,确定异欧前胡素对SH-SY5Y细胞凋亡的影响。3.分析异欧前胡素对STS诱导的细胞内信号通路的影响异欧前胡素预先处理细胞1 h,然后加入共同含有异欧前胡素与STS的培养基继续培养细胞4 h,使用Western blot技术检测胞内信号分子JNK、ERK、p38、AKT的磷酸化水平,揭示异欧前胡素的神经保护作用由哪几种信号通路介导。4.使用相关信号通路的特异性抑制剂检测验证对STS诱导的神经细胞凋亡影响各种特异性抑制剂预先处理细胞1 h后,再使用STS处理细胞构建体外细胞凋亡模型,采用Western blot的方法检测凋亡标志蛋白cleaved PARP的表达情况,CCK-8法检测细胞存活力,分析相关信号通路在异欧前胡素保护神经细胞抵抗STS诱导凋亡中的作用。结果1.异欧前胡素的使用浓度增加到40μM时,对SH-SY5Y细胞的生存活力仍无显著影响;2.异欧前胡素对STS诱导的SH-SY5Y细胞毒性具有神经保护效果;3.异欧前胡素能够抑制STS诱发的胞内信号通路MAPK通路的活化;同时对STS诱发的AKT信号通路的活化起到促进作用;4.在SH-SY5Y细胞中,使用相应的特异性MAPK抑制剂能够模拟异欧前胡素对STS诱导的细胞毒性的保护作用;使用AKT特异性抑制剂处理SH-SY5Y细胞后,促进了STS诱导的SH-SY5Y细胞的凋亡。结论通过研究异欧前胡素发挥神经保护作用的分子机制,发现异欧前胡素通过抑制MAPK信号通路,激活PI3K/Akt信号途径保护SH-SY5Y细胞免受STS诱导的细胞凋亡。这提示我们异欧前胡素可能在神经退行性疾病的治疗中发挥重要作用,对临床上开发治疗神经相关性疾病的新药提供新的理论依据。
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