【摘 要】
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近年来,厌氧氨氧化（anaerobic ammonia oxidation,Anammox）与硝酸盐/亚硝酸盐型反硝化厌氧甲烷氧化（nitrate/nitrite-dependent denitrifying anaerobic methane oxidation,DAMO/N-DAMO）组合工艺的提出为“下一代”能源自给型污水处理模式的建立带来了巨大希望。针对DAMO古菌和N-DAMO细菌固有的
【基金项目】
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国家重大科技专项课题“涪陵页岩气绿色开发技术示范”（2016ZX05060-005）； 国家自然科学基金项目“有机碳源下厌氧氨氧化菌群落结构与氮代谢途径研究”（51208491）； 国家自然科学基金项目“页岩气产出水早期收集过程有机物转化规律与微生物作用机制研究”（41977414）；
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近年来,厌氧氨氧化（anaerobic ammonia oxidation,Anammox）与硝酸盐/亚硝酸盐型反硝化厌氧甲烷氧化（nitrate/nitrite-dependent denitrifying anaerobic methane oxidation,DAMO/N-DAMO）组合工艺的提出为“下一代”能源自给型污水处理模式的建立带来了巨大希望。针对DAMO古菌和N-DAMO细菌固有的富集艰难、环境条件敏感等缺陷,已有研究陆续在自然环境中发现传统好氧甲烷氧化菌（aerobic methane oxidizing bacteria,MOB）主导的好氧甲烷氧化耦合反硝化（aerobic methane oxidation coupled with denitrification,AME-D）过程能在低氧/缺氧环境下通过联合反硝化菌实现类似DAMO/N-DAMO的反应,以此推测利用缺氧AME-D替代DAMO/N-DAMO与Anammox组成的新型微生物碳氮转化工艺在理论上具有更可观的应用前景。鉴于此,本论文以AME-D工艺为切入点,首先在小试条件下获得了长期稳定运行的耐缺氧AME-D微生物富集体,详细研究了其基本运行特征,并采用稳定性同位素核酸探针（DNA based stable isotope probing,DNA-SIP）结合基因组分辨的宏基因组分析手段深入揭示参与甲烷与氮素转化功能微生物的代谢特性;在此基础上进一步构建缺氧AME-D-Anammox联合工艺小试反应体系,验证其中主要功能菌共存的可行性,为基于缺氧AME-D工艺的生物脱氮技术的研发和放大应用提供理论依据。本文获得主要研究结果如下:（1）缺氧AME-D工艺（DO＜0.010 mg/L）长期运行结果表明,甲烷气体循环的运行模式能明显提升工艺的亚硝酸盐去除效率（从8.44 mg N/L/d增至63.43 mg N/L/d）,此阶段消耗NO2--N/CH4摩尔比介于0.73～1.30之间,相比于N-DAMO工艺理论化学计量式,更接近以亚硝酸盐为底物的好氧AME-D工艺的理论计量式。此外,缺氧型AME-D工艺体系内代谢产生挥发性脂肪酸以乙酸盐为主,单周期内累积量高达2012±17.71μg/L。（2）缺氧AME-D体系中DNA-SIP结合宏基因组学研究结果表明,提升甲烷通量可使优势MOBs、普通型和甲基营养型反硝化菌得到进一步富集,Methylomonas是该体系中甲烷氧化的主要贡献者。通过宏基因组binning重构得到2条Methylomonas属、1条Methylococcus属MOBs和1条甲基营养反硝化菌全基因组草图序列,并从中注释到多个氮同化/异化代谢相关基因,特别是与Methylococcus capsulatus str.Bath亲缘关系最近的bin-50能编码关键反硝化基因nir S和nor BC;MOBs相关序列还携带甲酸、乙酸、琥珀酸等小分子有机酸转化的主要基因。表明该缺氧AME-D系统中以Methylomonas为主的MOBs具有部分反硝化潜能,并通过生成小分子有机酸和甲醇等代谢产物与反硝化菌间实现营养共生。（3）由于缺氧AME-D工艺具有累积有机酸的特性,在启动AME-D-Anammox联合工艺前,首先探究在以乙酸钠为有机碳源的低COD/TN条件下普通Anammox工艺稳定运行的可行性及微生物作用机制。结果表明:普通自养Anammox工艺能够适应此类环境条件,稳定运行后TN去除量高于70 mg N/L/d,其中Anammox对脱氮贡献率达67.53±1.22%,是反硝化过程对脱氮贡献的两倍。Ignavibacterium、Thauera、Denitratisoma、Calorithrix等异养菌和Candidatus Jettenia是该兼性营养体系中有机碳的主要利用者。通过宏基因组binning在该系统中获得1条Candidatus Brocadia属和1条Candidatus Jettenia属全基因组草图序列,两者均携带丰富的乙酸代谢基因。（4）在明确Anammox工艺能耐受有机酸环境后,分别以上述两种富集活性污泥混合接种,顺利启动缺氧AME-D-Anammox工艺。联合工艺运行50天内TN去除量从16.42 mg N/L/d逐渐升至127.97 mg N/L/d。活性实验计算表明,添加甲烷的联合体系中,Anammox过程对TN去除量的贡献达79.12%,AME-D过程对TN去除量的贡献达20.88%。此外,该缺氧AME-D-Anammox体系中的传统MOBs和Anammox种群结构与接种体系均不相同,以Type Ib型Methylococcus属和Candidatus Brocadia属为主。
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