旁分泌细胞载体型凝胶微球的构建及其用于创伤修复中炎症调控的研究

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目前,体表创伤的治疗方法主要为使用纤维材料敷料,或负载抗炎药物,从而达到吸渗、隔菌、炎症调控和促愈合的效果。但遇到面积大和创口深的创面时,传统敷料低吸渗,载药量有限,易粘连等缺点导致其炎症调控能力弱,不能满足重大创面的临床治疗现状。旁分泌效应作为机体自身的一种高效抗炎促修复方式,受传统敷料材料不能负载细胞、制备过程有生物毒性等限制,很难与其结合用于重大创伤的炎症调节。因此,本文通过使用天然大分子材料构建细胞负载型凝胶微球载体,负载旁分泌细胞并维持其表型,创新性的构建出外源性旁分泌效应供给体系,能够用于可注射水凝胶敷料,为新型敷料在重大体表创伤中实现高效持久的炎症调节提供方案。根据上述设计,本论文开展了以下研究。首先,利用低温琼脂糖在细胞存活温度区间可控交联的特点,通过单乳液法制备琼脂糖基凝胶微球,具体探究了水相浓度、水油比、搅拌速度,对载体微球的理化特性影响。将优化后的载体制备工艺(水相浓度2.5%(w/v),水油比1:5,搅拌速率600 rpm),选用小鼠单核巨噬细胞(RAW264.7)作为旁分泌细胞代表进行负载,构建了旁分泌细胞负载型凝胶体系,实现了旁分泌细胞的三维(3D)培养。通过细胞增殖实验表明凝胶载体可支持细胞存活至少10天,远超二维(2D)水平。通过旁分泌效应相关标志物的表达分析,发现负载体系中细胞的旁分泌相关功能与文献发现的旁分泌效应(2D细胞)mRNA层面接近,证明了外源性旁分泌效应供给体系应用的可能。鉴于琼脂糖基凝胶微球体系还存在部分细胞泄漏、细胞增值速率过快等问题。选用明胶和海藻酸复合模拟细胞外基质,为细胞提供更多的生物活性位点,进一步改进旁分泌细胞负载体系。改进后的明胶/海藻酸基凝胶复合材料(Ge/SA)可负载RAW264.7细胞和兔脂肪间充质干细胞(ADSCs)。结果证明新的细胞负载体系无泄漏且细胞增殖稳定。Ge/SA微球中的RAW264.7和ADSCs的旁分泌相关基因的表达相对于大多发生了上调,证明Ge/SA体系构建的外源性旁分泌效应体系在创伤修复炎症调节更具有优势。最后,结合实际应用情况,选择Ge/SA凝胶体系负载细胞,将诱导极化过的RAW264.7和ADSCs以1:1的比例混合包裹在海藻酸钙凝胶(模拟可注射临床操作)内,放置于体外共培养构建的炎症调节模型和上皮促愈合模型中,探究Ge/SA凝胶负载构建的外源性旁分泌效应系统的实际应用,结果表明细胞载体型微球构建的外源性旁分泌功能体系的抗炎促修复功能优于现有文献报道的旁分泌效果。综上所述,本论文通过使用水凝胶材料改变细胞生长环境,模拟天然基质提供的生物位点,创造性的实现外源性的旁分泌效应的系统构建,为实现可注射水凝胶敷料进行重大体表创伤修复的治疗提供策略和参考数据。
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