第一部分:轴向加载力学环境-椎间盘退变的微纳环境变化[目的]在微纳观层面观察轴向加载致椎间盘退变的生物力学环境变化。[方法]发育成熟的雄性SD老鼠(平均体重400±15 g)35只,随机分为5组(每组7只):对照组(Control,未对椎间盘进行任何干预)和四个干预组(使用定制的外固定装置来固定尾椎(Co7-Co10,对目标间隙Co8-Co9分别予以压缩2、4、6及8周)。在实验的各个时间节点对大鼠尾椎进行MRI及X线检测,评估椎间盘T2信号强度和椎间盘高度。实验结束后,予以大鼠安乐死,收集尾椎间盘进行组织病理学、糖胺聚糖(GAG)含量、终板结构、椎间盘弹性模量等检测评估。[结果]基于经典的Pfirrmann分级标准,我们在Pfirrmann Ⅱ级时显微镜下观察到了早期的椎间盘退变(Pfirrmann Ⅰ级和Ⅱ级,临床通常定义为“正常”状态)。Co8-Co9压缩2周后,椎间盘由Pfirrmann Ⅰ级过渡为Ⅱ级。此时,糖胺聚糖渐进性减少和水分的丢失导致髓核细胞异常再生。大而空泡状的脊索细胞逐渐被小而不活跃的成熟髓核细胞所取代,髓核细胞密度逐渐增大,且呈不均匀分布。功能细胞数量从Pfirrmann Ⅰ级的平均1404个下降到Ⅱ级的平均1244个(p<0.05)。组织学评分从Pfirrmann Ⅰ级的5.21分上升到Ⅱ级的5.57分(p<0.05)。然而,在Pfirrmann Ⅰ和Ⅱ级之间,髓核的总GAG含量未见显著差异(p>0.05)。经过4周轴向加载后,椎间盘退化为Pfirrmann Ⅲ级(临床早期变性期),此时髓核呈现出典型的细胞簇现象,水含量进一步减少。髓核细胞密度低于Ⅰ级和Ⅱ级。伴随着髓核和纤维环内层出现紊乱,部分纤维环出现裂隙。Pfirrmann Ⅲ级时髓核总GAG含量较Pfirrmann Ⅱ级显著降低(p<0.0001)。Co8-Co9经过6周的加载后,椎间盘退变为Pfirrmann Ⅳ级(中晚期临床变性),髓核细胞密度明显低于Ⅰ-Ⅲ级。髓核体积和总GAG含量也进一步减少,纤维环内外层明显紊乱,髓核与纤维环界限模糊,部分髓核被紊乱的肉芽组织和瘢痕组织所替代,软骨终板明显纤维化,椎间隙轻至中度狭窄。Co8-Co9经过8周的压缩后,椎间盘退变为Pfirrmann Ⅴ级(临床终末期变性),髓核水含量几乎完全消失,近乎完全被肉芽组织和瘢痕组织所替代。与Pfirrmann Ⅰ-Ⅲ级相比,V级大鼠髓核总GAG含量显著降低(p<0.0001),然而,Pfirrmann Ⅳ和Ⅴ级之间髓核总GAG含量未见明显差异(p>0.05)。此外,伴随着纤维环广泛纤维化及终板的硬化、甚至塌陷,髓核细胞几乎消失殆尽,组织学评分上升到14.43。与此同时,在Pfirrmann分级早期(Ⅰ-Ⅱ级)骨性终板的孔隙结构未见明显变化,但随着Pfirrmann分级(Ⅲ-V级)的增加,孔隙数量渐进性减少。骨性终板呈现粗糙的“虫噬样”破坏,同时伴有钙化、硬化及骨赘形成,终板的中央区域较外周区域更为明显。随着加载时间的延长(6-8周,Pfirrmann Ⅳ-Ⅴ),骨性终板结构进一步退化,且与时间呈正相关。经过2-8周的加载压缩,纤维环胶原纤维的单个纤维直径明显粗于对照组,且Pfirrmann Ⅰ-Ⅴ级的外层胶原纤维直径均较内层显著增大。在退变早期(Pfirrmann Ⅱ),纤维直径与对照组相比未见明显变化,但随着压缩时间延长(Pfirrmann Ⅲ-Ⅴ),平均纤维直径显著增加(p<0.05)。与纤维直径所不同的是,在退变早期(Pfirrmann Ⅱ)与对照组(Pfirrmann Ⅰ)相比外层胶原纤维刚度均较内层胶原纤维刚度更大,即更硬一些(p<0.05),但内层胶原纤维相比未见明显差异。而在Pfirrmann Ⅲ级时,外层胶原纤维的平均弹性模量明显高于对照组(Pfirrmann Ⅰ,p<0.05),但纤维环内层仍未见明显差异。在Pfirrmann Ⅳ和V,纤维环内外层胶原纤维刚度均明显增大(p<0.05)。[结论]椎间盘退变最初是一个沉默的亚临床过程。依据经典的Pfirrmann评分标准,在通常定义为临床正常状态时(Pfirrmann Ⅰ和Ⅱ),椎间盘的微纳结构已发生早期退变改变,表明Pfirrmann分级与椎间盘微纳环境的变化并不同步。通过评价不同Pfirrmann分级下骨性终板、纤维环等亚结构的微纳结构改变,提高了我们对椎间盘退变发病机制和过程的认识,进一步揭示椎间盘退变不仅是宏观MRI所表现的髓核水含量的丢失,还进一步涉及纤维环、骨性终板及髓核等亚结构在微纳尺度的改变。第二部分:原位制动力学环境-椎间盘退变的微纳环境变化[目的]在微纳观层面观察原位制动力学环境椎间盘退变的生物力学环境变化。[方法]发育成熟的雄性SD老鼠35只(平均体重400±15 g),随机分为5组(每组7只):对照组(Control,尾椎椎体仅置入克氏针),四个干预组(使用定制的外固定装置原位制动尾椎Co7-Co10),分别对目标节段(Co8-Co9)予以2、4、6及8周的原位制动固定。依照实验设计,在实验的各个时间节点对大鼠尾椎进行MRI及X线检测,评估间盘T2信号强度和椎间盘高度。实验结束后,对大鼠施行安乐死,收集尾椎间盘进行组织病理学、椎间盘结构形态、基因表达、弹性模量的检测评估。[结果]椎间盘高度从制动第6周开始明显下降。在第6周和第8周,椎间盘退变依据改良的Pfirrmann评分标准为Ⅲ级。原位制动的力学环境改变了椎间盘的基因表达。伴随着制动时间的延长,髓核逐渐出现典型的细胞簇现象。与此同时纤维环内层也开始出现不规则紊乱伴裂隙形成。与对照组相比,制动8周组髓核内胶原纤维弹性模量明显降低(p<0.05),与此同时纤维环弹性模量明显增大(p<0.05)。[结论]原位制动力学状态导致了目标间盘的退变,且与制动时间呈正相关。椎间盘退变不仅与宏观和微观尺度的改变相关,而且还与胶原纤维在纳米尺度的变化有关。进一步表明原位制动力学环境是诱使椎间盘退变不可忽视的影响因素。第三部分:基于椎间稳定的可控制动牵引有助于轻中度退变椎间盘的再生修复[目的]探究及时可控的制动牵引能否恢复退变间盘的生物力学环境,进一步探讨牵引再生或修复退变间盘的可行性。[方法]49只6月龄的雄性SD大鼠(平均体重450±15 g)随机分为7组(每组7只)。A组(Sham):尾椎仅置入克氏针;B组(模型组):采用定制的外固定装置固定尾椎Co7-Co10并对目标间隙(Co8-Co9)进行4周的轴向压缩,致中度椎间盘退变;C组(实验对照组):同B组造模成功后移除外固定装置自行恢复;其余四个干预组(D-G组):Co8-Co9经历4周的压缩致中度椎间盘退变,然后分别予以2周、4周、6周和8周的轴向拉伸牵引。在实验的各个时间节点对大鼠尾椎进行MRI及X线检测,实验结束后,对大鼠施行安乐死,收集尾椎,对其间盘高度、T2信号强度、椎间盘组织病理学、髓核总GAG含量及骨性终板形貌进行测定。[结果]经过4周的轴向加载压缩,B-G组大鼠Co8-Co9椎体的椎间高度和T2信号强度较A组明显降低(Sham组,p<0.0001)。B组组织学评分平均为10.14分,髓核总糖胺聚糖(GAG)含量平均为238.21μg GAG/ng DNA。与对照组(A组)相比,骨性终板的结构也发生了明显变化。经过轴向制动牵引2-8周后,与B组相比,E组Co8-Co9的椎间隙及T2信号强度明显恢复(p<0.0001),D组、F组及G组Co8-Co9间盘高度也有了明显的改善(p<0.0001),与此同时,T2信号强度也较B组明显恢复(p<0.001)。组织学评分从B组平均10.14分降至F组5.86分及E组5.57分(p<0.0001)。另外,髓核总GAG含量也从B组的平均238.21μg GAG/ng DNA上升到E组的601.02μg GAG/ng DNA(p<0.0001)。此外,D组和E组的骨性终板孔隙密度均较B组显著增加(D组vs B组,p<0.05;E组vs B组,p<0.0001)。[结论]通过成功构建生物力学退变模型,进一步表明椎间盘退变是在异常力学环境下由细胞介导的生化、力学和结构变化的级联反应。不是所有程度的椎间盘退变都能够再生或修复。再生修复退变间盘需要特定的环境及条件。基于制动-牵引模式,在一定程度上中断了椎间盘退变的级联循环,但其牵引载荷的加载周期和幅度必须是适度可控的,若超出其生理力学范围可能导致更严重的退变。为临床制定干预策略及优化牵引装置的使用提供参考。第四部分:低张力牵引模态积极重塑退变间盘微纳环境[目的]观察低张力牵引模态再生修复退变间盘的可行性,并探讨其可能机制。[方法]42只6月龄雄性SD大鼠,体重(435±15 g),随机分为6组(每组7只):A组(模型组,使用定制的外固定装置固定尾椎Co7-Co 10并对目标间隙(Co8-Co9)进行4周的轴向压缩致中度椎间盘退变);B组(实验对照组,同A组造模成功后移除外固定装置自行恢复);剩余4个干预组(C-F组)C、E组同A组建模成功后分别予以2周及4周的高张力牵引(HTT-2w和4w);D、F组同A组建模成功后分别予以2周及4周的低张力牵引(LTT-2w和4w)。依照实验计划在各个时间节点对大鼠尾椎进行MRI及X线检测。实验结束后,对大鼠施行安乐死,收集尾椎,对实验节段椎间盘高度、T2信号强度、组织病理学、髓核总蛋白多糖含量、骨性终板形貌、髓核及纤维环胶原纤维直径及弹性模量进行测定。[结果]经持续轴向牵引2-4周后,C-F组大鼠的Co8-Co9椎间隙较A组明显增大(p<0.05)。所有四个干预组(C-F)的组织再生迹象均较B组明显。干预组(C-F)的组织学评分明显低于模型组(A组)和实验对照组(B组),其中LTT组(2周和4周组)均要优于HTT组(2周和4周组)。与模型组(A组)相比,干预组(C-F组)髓核总蛋白多糖含量显著增加(p<0.05)。经2-4周的干预后(HTT和LTT组),与A组相比,骨性终板孔隙形态、数量及直径明显恢复,LTT组优于HTT组,LTT-4w组明显优于LTT-2w组。在所有干预组中,内外层纤维环的平均胶原纤维直径均明显下降(p<0.05),但HTT组的纤维直径仍大于LTT组。与胶原纤维直径变化趋势一致,外层纤维环刚度较内层纤维环刚度更大。而在髓核中,胶原纤维直径和模量的变化趋势与纤维环基本一致,所不同的是4个干预组对髓核弹性模量的影响未见明显统计学差异(p>0.05)。[结论]本部分研究再次证实制动-牵引模式在一定程度上阻断了椎间盘退变的级联反应。低张力牵引模式减少了椎间盘的过度应力修复和骨赘形成。在促进退变间盘细胞外基质合成的同时,更好地重建了骨性终板,相比高张力牵引模式更有效改善了纤维环及髓核的微纳结构及力学微环境,且维持了退变间盘微环境的稳定,为退变间盘再生及修复重建提供了更好的保障。第五部分:低能量体外冲击波协同低张力牵引更好地促进中重度退变间盘的再生修复[目的]探究低能量体外冲击波联合低张力牵引对中重度退变间盘再生或修复的可行性,并探讨其可能机制。[方法]6月龄雄性SD大鼠35只(平均体重450±15 g),随机分为5组(每组7只):A组(模型组,使用定制的外固定装置固定尾椎Co7-Co10并对目标间隙(Co8-Co9)进行4周的轴向压缩构建力学退变模型);B组(实验对照组,同A组造模成功后移除外固定装置进行8周的自由恢复);剩余3个干预组:C组(com-4w/tra-4w组)同A组建模成功后予以4周的低张力牵引;D组(com-4w/ESWT)同A组建模成功后予以低能量体外冲击波治疗(ESWT)(强度:0.15Mpa,频率:1Hz,冲击次数:1000/次,1次/周,共4次)干预;E组(com-4w/tra-4w/ESWT组,ESWT治疗参数同D组)同A组建模成功后予以低张力牵引联合低能量ESWT干预。遵照实验计划在实验各时间节点对大鼠尾椎进行MRI及X线检测。实验结束后,对大鼠施行安乐死,收集大鼠尾椎,对其实验节段椎间盘高度、T2信号强度、组织病理学、髓核总GAG含量、椎间盘合成代谢及分解代谢基因表达、骨性终板形貌、髓核及纤维环胶原纤维直径及弹性模量进行评估测定。[结果]退变椎间盘经持续低张力牵引、低能量ESWT干预或二者联合干预治疗后均能有效恢复椎间盘高度,诱导椎间盘再水化,但对于椎间盘高度的恢复,D组(com-4w/ESWT组)要弱于别的两组干预组(C组和E组),而对于诱导椎间盘再水化,则E组(com-4w/tra-4w/ESWT组)更胜一筹。C-E干预组经不同方式干预后,三组椎间盘均呈现出组织再生迹象。但实验对照组(B组)椎间盘未见明显组织再生。三个干预组(C-E组)的组织学评分均较A组及B组降低(p<0.0001),其中C组和E组评分均与D组有明显的统计学意义(p<0.05),但C组与E组的组织学评分无统计学意义(p>0.05)。B组与各干预组(C-E组)相比,其NP总GAG含量未见明显增加(p<0.05)。NP总GAG含量在A组和B组间未见明显差异(p>0.05)。三个干预组中,D组NP总GAG含量恢复较C组及E组弱,其中C组vs D组(p<0.05),E 组 vs D 组(p<0.0001),而 C 组 vs E 组(p<0.05)。各干预组改变了椎间盘的合成代谢和分解代谢基因的表达。各干预组明显上调了 AF中Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原和aggrecan基因表达(p<0.05),其中三个干预组对Ⅰ型胶原的调控未见明显统计学差异(p>0.05);与此同时下调了 MMP-3、MMP-13及ADAMTs-4的基因表达(p<0.05)。其中三个干预组对ADAMTs-4的调控未见明显统计学差异(p>0.05)。与AF趋势基本一致的是各干预组上调了髓核中Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原及aggrecan的基因表达(p<0.05),同时下调了 NP中MMP-3、MMP-13及ADAMTs-4基因表达水平(p<0.05)。其中对于合成代谢基因的调控,D组除Ⅱ型胶原外,其余要弱于C组及E组,其中E组调控最佳。经过各干预组(C-E组)干预后,与A组相比,骨性终板的孔隙结构呈现明显的恢复变化。C-E组终板孔隙数较A组明显增多(p<0.0001),其中 C 组 vs D 组(p=0.9724);C 组 vs E 组(p=0.0116);但 A 组与 B 组未见明显统计学差异(p=0.5261)。此外孔隙直径也较前改善,其趋势与孔隙密度的趋势基本一致,所不同的是三个干预组之间并未见明显统计学差异(p=0.7213)。但值得注意的是,与A组及B组相比,D组(com-4w/ESWT组)及E组(com-4w/tra-4w/ESWT组)的骨性终板外周孔隙密度及孔径均得到明显恢复,而C组(com-4w/tra-4w组)则恢复较差。AF及NP中胶原纤维的弹性模量和直径随干预类型不同而变化,可以明确的是低张力牵引联合低能量ESWT干预对胶原纤维直径及模量的改善最大。[结论]低能量ESWT联合低张力牵引为中重度退变间盘的再生修复提供了更稳定的椎间环境。低能量ESWT通过降低MMP-3、MMP-13及ADAMTS-4和抑制胶原蛋白分解促进了间盘基质的再生。在轴向牵引促进间盘高度恢复及再水化的同时,联合低能量ESWT积极重建了骨性终板微纳结构,降低了纤维环的环张力及髓核的核应力,重塑了间盘再生修复必需的生物力学微环境。