论文部分内容阅读
目的:1、检测Axitinib对肝癌细胞增殖,细胞周期和细胞凋亡的影响,并初步揭示其中复杂的分子机制。2、为Axitinib作为临床上治疗此类肝癌细胞的辅助方案提供参考。同时,为设计和研发更有效的分子靶向药物提供实验依据。方法:1、MTT法筛选对Axitinib敏感的肝癌细胞株。设置一定浓度梯度的Axitinib,分别作用于BEL-7402细胞、SK-Hep1细胞、HepG2细胞、SNU-423细胞等肝癌细胞株,应用MTT法检测各类细胞的生存能力,通过分析比较,确定对Axitinib敏感的细胞株。2、应用细胞克隆形成实验、Hoechst染色法、流式细胞术和Western blot分别检测不同浓度下的Axitinib对SNU-423细胞增殖能力、细胞凋亡和细胞周期的影响。3、通过蛋白质印记实验初步探索Axitinib影响SNU-423细胞株生存及增殖过程的分子机制。结果:1、通过对四种肝癌细胞株进行药敏检测,筛选出了对多靶点酪氨酸激酶抑制剂Axitinib最为敏感的细胞株SNU-423。2、细胞克隆形成实验的结果显示,Axitinib对SNU-423细胞的集落形成能力具有明显的抑制作用,且这种抑制作用呈现良好的浓度依赖关系。进而表明Axitinib对SNU-423细胞的增殖具有较强抑制作用。3、细胞凋亡的检测结果表明,随着Axitinib浓度的增加,相同视野下,处于凋亡过程的SNU-423细胞所占的比例也随之增大。而用Western blot对相关凋亡蛋白Cleaved Caspase-3及Bcl-2表达量的检测,同样表明,Cleaved Caspase-3蛋白的表达量随着Axitinib浓度的增加,其蛋白条带的灰度也成正相关的增大;而Bcl-2蛋白的表达量随着Axitinib浓度的增加显著地降低。总体而言,Axitinib能够促进SNU-423细胞凋亡,且细胞的凋亡情况与药物浓度具有依赖关系。4、细胞周期的流式检测及相关周期蛋白Cyclin D1的Western blot检测结果表明,经不同浓度的Axitinib处理后,SNU-423细胞的周期动力学出现显著的差异,其中被阻滞在G1期的细胞所占的比例随Axitinib浓度的增加而增高。因此,Axitinib能够引起SNU-423细胞的G1期阻滞。5、蛋白质印记实验结果表明,SNU-423细胞经不同浓度的Axitinib作用后,细胞内的VEGFR2、p38 MAPK、Src和P-Src(Tyr527)、Akt和P-Akt(Thr308)、MEK1/2以及Erk1/2的表达量均未受到显著影响,这些蛋白的表达量均保持相对稳定。P-p38MAPK、P-Src(Tyr416)、P-Akt(Ser473)和P-MEK1/2这些蛋白的表达量与Axitinib浓度梯度间呈现正相关性,即随着药物浓度的增大,蛋白的表达量也随之增高。在1μmol/L至10μmol/L实验组中,Axitinib能够显著地抑制P-VEGFR2蛋白的表达,且随着药物浓度的增加VEGFR2的磷酸化显著性地降低。在1μmol/L和5μmol/L药物浓度实验组,P-Erk1/2的表达量相较于Control组而言,随药物浓度的增大而增高;而10μmol/L药物浓度实验组,P-Erk1/2的表达量相较于Control组而言则保持相对的稳定性。结论:1、多靶点酪氨酸激酶抑制剂Axitinib对肝癌细胞株(BEL-7402细胞、SK-Hep1细胞、HepG2细胞、SNU-423细胞)的生存及增殖能力均存在不同程度的抑制作用。其中SNU-423细胞生存及增殖能力所受的抑制作用最强,对Axitinib最为敏感。2、多靶点酪氨酸激酶抑制剂Axitinib能够通过浓度依赖性的方式抑制SNU-423细胞增殖,促进细胞凋亡,诱导细胞G1期阻滞。3、Axitinib可通过特定的信号分子促进p38 MAPK蛋白的磷酸化,进而激活p38MAPK蛋白相关信号通路,最终诱导SNU-423细胞完成caspases依赖性细胞凋亡过程。