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肝细胞性肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是全球高发的恶性肿瘤之一，其死亡率位居恶性肿瘤的第3位，其恶性程度高，5年生存率低，已成为人类最重视的健康问题之一。目前，中国原发性肝癌患者人数占全世界患者总人数的比例很高，约有50%以上，据统计每年我国约有23万人死于该疾病。在肝癌的治疗方面，由于外科手术及其他治疗手段的发展使一部分患者的生命得到延长，但治愈效果不容乐观。因此,提高对肝癌疾病发病的分子机制的理解与认识，使肝癌患者的预后得到改善刻不容缓。 近年来的研究发现天然免疫在肿瘤免疫中发挥着双向的调控作用，既能维持宿主寄生菌群平衡、清除死亡或突变细胞而抑制肿瘤的发生，又能诱导慢性炎症、形成炎性微环境而在肿瘤的发生发展中发挥重要作用。NOD样受体(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptors，NLRs)作为天然免疫识别受体(pattern recognition receptors, PRRs)家族中的一员，其家族中的成员如NOD1、NOD2、NLRP1、NLRP3、NLRP7及NLRP12等，与肿瘤特别是胃肠道肿瘤的发生发展联系密切。NLRC5(NLR family, CARD domain containing5)为一种新发现的免疫调节因子，是NLRs家族的成员之一。研究发现NLRC5可通过调控NF-κB、I型干扰素（IFN-I）、炎症体通路以及MHC-I基因的表达来参加机体的免疫调节，但其中具体的作用机制尙未研究清楚。本实验室前期研究发现NLRC5可通过正向调控Wnt/β-catenin信号通路促进肝癌细胞的增殖，迁移和侵袭，过表达NLRC5可促进裸鼠移植瘤的形成。 血管内皮生长因子-A(VEGF-A)是促进肿瘤中血管形成的主要因子之一。研究发现VEGF-A在肝癌中高表达并与其临床分期和预后有关。然而NLRC5是否能促进人肝癌细胞HepG2中VEGF-A的表达以及其中的机制还不清楚。本课题以人HepG2肝癌细胞为研究对象，深入探讨NLRC5在HepG2肝癌细胞中对VEGF-A的调控作用及机制，从而进一步完善有关于肝癌发生发展的机制研究。主要研究内容如下： 1. NLRC5和VEGF-A在人肝癌组织和细胞中的表达 收集人肝癌组织和癌旁正常肝组织（距离肝癌组织≥0.5cm），利用免疫组织化学染色和Western Blot法检测人肝癌组织中NLRC5和VEGF-A的表达变化。结果发现，NLRC5和VEGF-A在肝癌组织中较癌旁正常组织表达升高，差异有统计学意义。Western Blot法检测人正常肝细胞株L02和人肝癌细胞株HepG2, SMMC-7721和BEL-7402中NLRC5和VEGF-A的蛋白表达水平。其结果发现，三种人肝癌细胞株中NLRC5和VEGF-A的蛋白表达与正常组比较均升高，与对照组相比差异有统计学意义。 2. NLRC5和VEGF-A在肝癌裸鼠荷瘤模型中的表达变化 将稳定干扰表达NLRC5的HepG2细胞株(shNLRC5)和对照组细胞(control)分别皮下注射入裸鼠左前肢腋下，建立肿瘤模型。待25天后，每三天使用游标卡尺量取并记下每只裸鼠右腋下肿瘤的长径以及短径，绘制出生长曲线，结果发现shNLRC5组较control组明显抑制肿瘤体积的增长。43天后，剥离肿瘤并拍照，其结果发现shNLRC5组肿瘤体积明显较control组小。将剥离肿瘤进行称重，发现shNLRC5组肿瘤重量较control组减小，差异有统计学意义。提取肝肿瘤组织蛋白，Western Blot检测裸鼠肝癌模型中NLRC5, VEGF-A的蛋白表达，结果发现shNLRC5组中NLRC5, VEGF-A的蛋白表达较control组显著降低，差异有统计学意义。 3. NLRC5表达上调后对VEGF-A表达和细胞增殖的影响 为研究NLRC5对VEGF-A的影响，本实验在过表达NLRC5后通过Western Blot法、qRT-PCR法和Elisa法检测了VEGF-A的表达。结果发现，NLRC5过表达后VGEF-A表达与对照组相比显著升高，差异有统计学意义。为了观察过表达NLRC5对肝癌细胞增殖能力的影响，应用MTT、细胞克隆形成实验和流式检测细胞周期实验发现，细胞过表达NLRC5后肝癌细胞HepG2的增殖能力能明显增强。上述结果表明，过表达NLRC5后可增加VEGF-A的表达，并促进HepG2人肝癌细胞的增殖。 4. NLRC5表达下调后对VEGF-A表达和细胞增殖的影响 为研究NLRC5表达下调后对VEGF-A的影响，本实验在沉默NLRC5后应用Western Blot法、qRT-PCR法和Elisa法检测了VEGF-A的表达。结果发现，NLRC5表达下调后VEGF-A表达与对照组相比显著降低，差异有统计学意义。为了观察NLRC5表达下调后对肝癌细胞增殖能力的影响，应用MTT法、细胞克隆形成实验和流式检测细胞周期实验发现，NLRC5表达下调后与对照组相比明显抑制了肝癌细胞的增殖，抑制细胞克隆形成，使更多细胞停滞在G1期。以上结果表明，NLRC5表达下调后可抑制VEGF-A的表达，并抑制肝癌细胞的增殖。 5. NLRC5调控VEGF-A的部分机制研究 为研究NLRC5对VEGF-A的表达调控并研究其影响肝癌细胞增殖的作用机制，本实验应用Western Blot法检测pAKT(s473), AKT在人肝癌组织中的表达。实验发现pAKT(s473)蛋白在人肝癌组织中较癌旁正常肝组织表达升高，差异有统计学意义。过表达NLRC5后，经Western Blot法检测发现，与对照组相比，NLRC5过表达后pAKT(s473)蛋白表达明显升高，NLRC5表达下调后则结果相反，差异有统计学意义。另一方面我们用LY294002（25Μm, PI3K/AKT信号通路抑制剂）刺激空载体（pEGFP-C2）转染组和过表达NLRC5的HepG2细胞，经Western Blot法检测发现，与空载体转染组相比，pAKT(s473)蛋白的表达在过表达NLRC5组显著升高；经LY294002刺激后，空载体转染组和过表达NLRC5的HepG2细胞pAKT(s473)蛋白表达分别较其未刺激组下降，差异有统计学意义。qRT-PCR法和Elisa法检测了VEGF-A的表达，其表达变化与pAKT(s473)蛋白的表达呈同一趋势。上述结果表明，NLRC5部分通过AKT/VEGF-A信号通路对肝癌细胞增殖发挥着重要地促进作用。 综上，本课题研究发现NLRC5促进HepG2肝癌细胞增殖可能与其调控AKT通路促进VEGF-A的表达有关。