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通过硫酸铵分级沉淀、DEAE-32阴离子交换柱、Sephadex G-100分子筛柱和CM-52阳离子交换柱,从猪精液中提取出碱性N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(N-acetyl-β-D-glucosaminidase,EC 3.3.1.52,简称NAGase)和酸性NAGase,比活力分别为17606.15 U/mg和1773.25 U/mg。两种酶的提取液经PAGE检测,均呈现一条蛋白条带。碱性NAGase经SDS-PAGE平板电泳呈现1种蛋白条带,亚基分子质量为64.30 kD,酸性NAGase则呈现2种蛋白条带,亚基分子质量分别为129.13 kD和62.24kD。碱性NAGase和酸性NAGase的等电点分别为9.42和5.10。以对-硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖(pNP-NAG)为底物,进行酶催化底物水解的反应动力学研究,结果表明:碱性NAGase和酸性NAGase催化底物反应的最适pH都是5.50,分别在pH3.0~8.90和pH 3.6~9.2区域较稳定;最适温度分别为50℃和60℃,酶活力分别在10℃~45℃和10℃~55℃的范围内保持稳定。碱性NAGase符合米氏双曲线方程,对于酸性NAGase,当底物浓度低于0.7 mmol/L时符合,底物浓度高于0.7 mmol/L时出现了底物抑制酶活性的现象。测得碱性NAGase米氏常数Km为1.94 mmol/L,最大反应速度Vm为27.53μmol/L/min,催化pNP-β-D-GlcNAc反应的活化能为88.73 kJ/mol。酸性NAGase米氏常数Km为0.46 mmol/L,最大反应速度Vm为17.34μmol/L/min,催化pNP-β-D-GlcNAc反应的活化能为41.70 kJ/mol。
研究金属离子对碱性NAGase的影响。结果表明:低浓度(1~10 mmol/L)的Na+和K+对酶活力没有影响。Cu2+、Zn2+、Mg2+、Ca2+、高浓度(0.1~1 mol/L)的Na+和K+对酶活力有不同程度的抑制作用。Zn2+、Ca2+、高浓度的Na+和K+对酶的抑制都表现为可逆非竞争性抑制类型,高浓度的Na+和K+对酶的抑制常数KI分别为0.47mol/L和0.32mol/L;Zn2+对酶的抑制常数KI为3.27 mmol/L;Ca2+对酶的抑制常数KI为65.28 mmol/L。
在特定浓度范围内,果糖、D-甘露糖和N-乙酰-D-氨基葡萄糖对碱性NAGase活力有不同程度的抑制作用。D-甘露糖对酶的抑制表现为可逆竞争性类型,它的抑制常数KI为18.36 mmol/L。N-乙酰-D-氨基葡萄糖对酶的抑制类型是可逆混合型抑制类型,抑制常数KI与KIS分别为16.98 mmol/L和55.26 mmol/L。
低浓度(2~20μg/mL)的恩诺沙星、环丙沙星、氯霉素、氟苯尼考对碱性NAGase活力没有影响。高浓度(0.1~1 mg/mL)的磺胺对甲氧嘧啶对酶活力没有影响。高浓度(0.1~1.5 mg/mL)的恩诺沙星和环丙沙星对酶活力有一定抑制作用。高浓度(0.2~2mg/mL)氯霉素有抵抗乙醇对酶活力的抑制作用。头孢拉定(0.5~15 mg/mL)对酶有先激活后抑制作用。
对于常用精液稀释液的主要成分,EDTA 2Na和VitaminC对碱性NAGase活力有激活作用,三羟甲基氨基甲烷(Tris)、碳酸氢钠、葡萄糖、柠檬酸三钠对酶活力有不同程度的抑制作用,Tris对酶活力的抑制作用最强,表现为可逆非竞争性类型,抑制常数为9.81 mmol/L。青霉素钾、硫酸链霉素和L-半胱氨酸对酶活力没有影响。
研究采精频率对酶活力的影响和比较不同品种猪精液NAGase活力。结果表明:一周采精两次对精浆NAGase活力没有影响,隔天采精和连续采精会导致精浆NAGase活力下降。杜洛克精浆NAGase活力比大约克、皮杜高,具有统计学上的差异(P<0.05)。3个品种每毫升精液的精子中NAGase含量不存在明显区别。