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本文主要从以下几方面进行了论述: 第一部分 目的:建立大鼠皮层神经元体外模拟缺血再灌注模型,探讨体外模拟缺血再灌注后大鼠皮层神经元内质网应激凋亡的机制,及线粒体、内质网凋亡途径之间的关系。 方法:体外培养SD乳鼠皮层神经元,免疫荧光染色鉴定神经元纯度;透射电镜观察细胞超微结构;流式细胞术AnnexinV、PI双标检测凋亡率及活性半胱天冬酶(Caspase)-3,-7,-9表达;Western-blot免疫印迹分析Caspase-12,葡萄糖调节蛋白78(glucose-regulated protein78,GRP78),细胞色素C(cytochrome C,Cyt c)蛋白表达。 结果:SD乳鼠皮层神经元可纯化体外培养,建立体外模拟缺血再灌注模型。实验发现体外模拟缺血再灌注损伤后,培养的大鼠皮层神经元Cyt c、GRP78免疫活性明显增加,而对照组只有很少表达。同时Annexin V-FITC和PI联合染色FCM检测缺血再灌注后神经元凋亡发生率显著高于对照组,并随再灌注时间延长而增加。流式分析、免疫印迹分析显示Caspase-3、Caspase-9、Caspase-12均参与了缺血再灌注后的神经元凋亡,未检测到足量活性caspase-7。透射电镜提示神经元缺血再灌注损伤后内质网、线粒体腔肿胀、变形,神经元呈现典型凋亡形态学改变。 结论:神经元可体外纯化培养,为后面的实验奠定了基础。形态学及生化特征均表明体外模拟缺血再灌注后神经元发生凋亡,caspase-12、caspase-3及caspase-9参与神经元缺血后凋亡,线粒体和内质网应激凋亡途径存在相互联系。 第二部分 目的:探讨过表达Bcl-2对体外模拟缺血再灌注后大鼠皮层神经元内质网应激凋亡的影响。 方法:体外培养SD乳鼠皮层神经元,免疫荧光染色鉴定神经元纯度。质粒瞬时转染;亚细胞结构分析;AnnexinV、PI双标流式细胞术检测凋亡率及FITC标记活性Caspase-3,-7,-9表达;Western-blot免疫印迹分析Caspase-12,GRP78,B细胞淋巴瘤/白血病-2基因((B-cell lymphoma/leukemia-2 gene,Bcl-2),Cyt c蛋白表达。 结果:SD乳鼠皮层神经元可纯化体外培养。皮层神经元体外模拟缺血再灌注后(缺血6h再灌注24h)GRP78、Caspase-3、caspase-9、caspase-12蛋白水平增加并可被过表达Bcl-2抑制(P<0.05),Bcl-2基因转染后Cyt c释放较未转染组减少(P<0.05),神经元缺血6h再灌注24h细胞凋亡率为17.95％±1.31;Bcl-2质粒转染后降至8.76%±1.09;各组与实验组比较有统计学意义(P<0.05)。 结论:外源性Bcl-2也存在亚细胞分布,过表达Bcl-2可抑制胞浆细胞色素c释放,减少活性caspase-3、caspase-9、caspase-12表达,降低GRP78免疫活性,提示Bcl-2对神经元凋亡的抑制作用是通过保护线粒体功能实现的。 第三部分 目的:探讨siRNA沉默细胞色素C基因对体外模拟缺血再灌注后大鼠皮层神经元内质网应激凋亡影响。 方法:体外培养SD乳鼠皮层神经元,免疫荧光染色鉴定神经元纯度;RNA干扰;亚细胞结构分析;流式细胞术AnnexinV、PI双标检测凋亡率及活性caspase-3、caspase-7、caspase-9表达;Western-blot免疫印迹分析亚细胞成分活性caspase-12、GRP78、Bcl-2、cyt c蛋白表达。 结果:SD乳鼠皮层神经元可纯化体外培养。培养神经元缺血6h再灌注24h细胞凋亡率为17.95%±2.09;Cyt c siRNA转染后凋亡率降至10.26%±1.37,两组比较有统计学意义(P<0.05)。体外模拟缺血再灌注诱导神经元GRP78表达上调,使Cyt c表达增加,Bcl-2表达减少。活性caspase-3、caspase-9、caspase-12表达增加。siRNA Cyt c基因静默促进细胞Bcl-2表达,降低GRP78、活性caspase-12免疫活性,减少活化的caspase-3、caspase-9含量。 结论:细胞色素c释放是多种凋亡途径的关键。应用RNA干扰技术抑制胞浆cyt c释放,不仅减少了活性caspase-3和caspase-9的表达,也降低了特异性位于内质网的caspase-12的免疫活性,同时增加了线粒体、内质网部分的 Bcl-2蛋白表达,提示抑制cyt c释放即可以保护线粒体功能,也可以降低内质网应激损伤。