目的:肿瘤细胞可以通过失去抗原性和/或免疫原性,或者通过诱导肿瘤抑制性免疫微环境而发生免疫逃逸现象。不同的肿瘤免疫逃逸机制决定了临床上不同的免疫治疗方案,因此探讨肿瘤免疫逃逸的分子机制对肿瘤免疫治疗的相关策略有着很重要的指导作用。在肿瘤的免疫逃逸过程中,T细胞介导的细胞免疫发挥着重要作用。在20-60%的常见实体癌中,如黑色素瘤、肺癌、乳腺癌、肾癌、前列腺癌和膀胱癌等,肿瘤细胞的MHC-I类分子发生表达下调或缺失,这种改变无法诱导CD8~+T淋巴细胞(CTL)识别和杀伤肿瘤细胞,是导致肿瘤免疫逃逸最重要的原因之一。MHC-I类分子的调控机制因肿瘤类型而异,这些改变可以是遗传或非遗传的,迄今研究认为,肿瘤细胞MHC-I类分子的调控主要分为表观遗传学调控,转录水平的调控或转录后水平的调控。SND1(Staphylococcal Nuclease And Tudor Domain Containing 1)蛋白是一种新定义的肿瘤蛋白,在几乎所有不同的肿瘤细胞中均高表达。同时,SND1也是一种在真核生物中广泛表达且高度保守的多功能蛋白,在多种细胞生理过程中起着重要的作用。目前的研究表明,SND1可以在细胞水平通过调节不同的信号通路促进肿瘤的发生和转移,然而,SND1对体内肿瘤发生和免疫微环境的影响尚无报道。因此本课题旨在深入探讨SND1与肿瘤免疫逃逸的相关性,以及SND1调控MHC-I类分子抗原呈递的分子机制。方法:本课题主要分为三部分:第一部分:(1)通过免疫亲和纯化实验与质谱分析发现SND1可以与MHC-I类分子的重链HLA-A结合;(2)通过免疫共沉淀、免疫荧光实验及Duolink邻位连接技术验证SND1在体内与HLA-A蛋白的结合,并判断二者相互作用的细胞定位。(3)通过体外纯化蛋白联合GST-Pulldown系统检测SND1蛋白与HLA-A蛋白相互结合的具体结构域,并通过晶体结构预测网站分析模拟二者结合的稳定构象;(4)通过利用含不同信号肽的内质网报告质粒(含绿色荧光蛋白)及免疫荧光实验分析SND1的N端序列对其在内质网定位的重要性。第二部分:(1)利用蛋白质印迹技术(Western Blot)及流式细胞术(Flow cytometry)来检测改变SND1的表达后不同肿瘤细胞(He La细胞及SKOV3细胞)表面MHC-I类分子的表达水平;(2)通过荧光定量聚合酶链式反应(Quantitative Polymerase Chain Reaction,q PCR)实验排除SND1对HLA-A的转录水平的调控;(3)通过改变SND1表达后利用免疫共沉淀技术检测HLA-A蛋白的泛素化水平,来进一步研究SND1是否影响了HLA-A蛋白的降解。(4)最后通过利用质谱分析技术、免疫共沉淀技术及Duolink邻位连接技术,进一步探究SND1促进HLA-A蛋白降解的具体分子机制。第三部分:(1)通过流式细胞术及Western Blot技术来检测敲除SND1后小鼠肿瘤细胞(B16F10细胞及MC38细胞)表面MHC-I类分子(H2Kb)的表达情况;(2)在动物水平通过对小鼠进行皮下成瘤实验,拍照和记录瘤体生长情况,之后通过免疫组化和流式细胞术分析瘤体中免疫细胞的浸润情况;(3)在体外通过克隆形成、CCK8实验检测SND1对小鼠肿瘤细胞增殖的影响,通过流式细胞术检测SND1对小鼠肿瘤细胞周期和凋亡的影响;(4)在体内通过对比无成熟T细胞的Rag1-/-小鼠及野生型C57BL/6小鼠皮下成瘤后瘤体的生长情况,探究SND1是否通过影响肿瘤细胞在体内的增殖或凋亡,亦或免疫细胞的浸润而影响瘤体的生长;(5)选用OT-I的转基因小鼠模型,研究SND1是否影响CD8~+T细胞介导的针对肿瘤细胞表面OVA特异性小肽的免疫应答;(6)通过检索临床样本数据库(TIMER及Progno Scan),分析病人肿瘤标本中SND1的表达与免疫细胞的浸润及患者的生存期是否有显著的相关性。结果:第一部分:(1)SND1蛋白可与新生的MHC-I类分子的重链HLA-A在体内特异性结合;(2)SND1的SN3结构域与HLA-A的A3结构域酸性氨基酸之间的静电相互作用可能在维持SND1-HLA-A复合物稳定性中起重要作用;(3)SND1蛋白可以通过其N端序列(35aa)结合到SEC61A通道上,而使其定位在内质网上。第二部分:(1)在人的不同肿瘤细胞中,敲除或敲低SND1后,HLA-A蛋白的表达升高,而外源性过表达SND1后,HLA-A蛋白的表达降低;(2)在He La细胞中改变SND1后,HLA-A蛋白的稳定性发生改变,SND1可通过蛋白酶体途径促进HLA-A的降解;(3)免疫共沉淀及Duolink实验显示He La细胞中过表达SND1后会抑制HLA-A与Calnexin及β2m的结合效率,并且HLA-A的糖基化位点突变后不影响HLA-A与SND1的结合;(4)He La细胞中过表达SND1后会促进HLA-A与ERAD(ER-associated degradation,内质网相关的降解)相关复合物(VCP和VIMP)及E3泛素化连接酶HRD1的结合。第三部分:(1)在不同小鼠的肿瘤细胞中敲除SND1后,小鼠的MHC-I类分子(H2Kb)表达升高;(2)小鼠B16F10及MC38细胞皮下成瘤后,SND1敲除后的瘤体更小,并且瘤体里浸润的CD8~+T细胞明显增多;(3)SND1在体内和体外对小鼠肿瘤细胞增殖、细胞周期及凋亡的影响均不明显;(4)在SND1敲除的肿瘤模型中恢复SND1的SN结构域的表达,会使瘤体浸润的免疫细胞发生改变,且瘤体大小也随之改变。(5)转基因OT-I小鼠的实验结果进一步证实了SND1通过影响特异性小肽的抗原呈递,从而影响瘤体组织中CD8~+T细胞的浸润。(6)检索TIMER及Progno Scan数据库发现,在黑色素瘤和结肠腺癌中,SND1与CD8~+T细胞的浸润及患者的生存期呈负相关。结论:(1)SND1蛋白可通过其N端序列与内质网通道蛋白SEC61A结合而定位于内质网,同时在内质网上其SN结构域与新生的HLA-A结合。(2)SND1在内质网上挟持了新生的HLA-A,抑制了HLA-A与Calnexin及β2m的结合,使其无法形成稳定的结构,不能组装为成熟的MHC-I类分子,并且促进了HLA-A进入ERAD途径发生蛋白酶体相关的降解。(3)肿瘤细胞中SND1通过影响MHC-I介导的抗原呈递作用而影响CD8~+T细胞介导的细胞免疫应答,从而促进了肿瘤的生长。此外,临床样本中SND1的表达与CD8~+T细胞浸润及患者总体生存率呈负相关。