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在肉制品的加工过程中,脂肪的降解主要由水解和氧化完成的,而肌肉中的磷脂是肌内脂肪的主要成分,肌内磷脂中不饱和脂肪酸的解离、氧化产物与其它物质发生美拉德反应形成风味物质,但涉及肉品风味品质的生化反应错综复杂,尤其挥发性风味的形成机制更是难以完全阐明。而实验室前期有关实验表明Hsp90α可与中性磷脂形成绑定体,对磷脂的水解有一定的影响。因此,本实验先从鸭肉中分离纯化出Hsp90α,再运用分子生物学技术,来获得高纯度的重组Hsp90α蛋白。经Western blot鉴定该蛋白为Hsp90α,并运用薄层析证明该重组蛋白具有稳定结合磷脂酰胆碱的活性。通过丙二醛的测定、磷脂水解产物测定实验来探究Hsp90α的抗氧化性及其抑制磷脂酶A2对磷脂的水解。最后运用蛋白互作仪实时监测Hsp90α与磷脂之间的相互作用,得出亲和力常数,从而判断结合特征。具体研究内容和结果如下:1.鸭胸肉中Hsp90α的提取、分离、纯化及碟脂结合活性的鉴定取鸭股二头肌,去除脂肪组织、结缔组织后剁碎,匀浆,经过70%的硫酸铵沉淀获取粗分离;粗蛋白用DEAE-52阴离子交换层析用A相(50 mM的Tris-HCl)平衡,100%B(50 mM Tris-HCl,1 M 的 NaCl,pH8.0)等度洗脱,分别收集洗脱峰;Source 15Q阴离子交换层析用100%B(50 mM的Tris-HCl,1 M的NaCl),35 min线性洗脱方式进行洗脱,分别收集洗脱峰;Superdex G200凝胶过滤层析用流动相50 mM的Tris-HCl(pH8.0)分离,分别收集洗脱峰。经电泳检测浓缩后,最终获得纯度较高的Hsp90α。经Western blot鉴定该蛋白为Hsp90α,并运用薄层析法证明该蛋白具有稳定结合磷脂酰胆碱的活性,2.麻鸭Hsp90α基因的原核表达、纯化及磷脂结合活性的鉴定运用分子生物学技术,以麻鸭骨骼肌细胞cDNA为模板扩增Hsp90α基因,并用1%的琼脂糖凝胶电泳检测,将PCR产物纯化回收后,连接至pMD19-T载体,转化至DH5α感受态细胞,挑取阳性单菌落进行培养,经菌落PCR、酶切和PCR鉴定,将连接正确的重组基因质粒送去测序。采用克隆技术,构建pCold1-Hsp90α重组质粒。将重组质粒转化至大肠杆菌经诱导得到菌液,经镍亲和柱层析,蛋白得到初步纯化,再用Superdex G200进一步纯化,最终获得纯度较高的Hsp90α。用蛋白定量试剂盒測定蛋白浓度,分装后置于-80℃保存。经Western blot鉴定该重组蛋白为Hsp90α,并运用薄层析证明该重组蛋白具有稳定结合磷脂酰胆碱的活性。3.Hsp90α与磷脂的相互作用制备脂质体,运用蛋白互作仪实时监测Hsp90α与磷脂的相互作用,得出两者之间有结合,并通过亲和力常数来判断结合特征。通过荧光分光光度法,确定Hsp90α与磷脂形成的绑定体能显著削弱磷脂酶A2对磷脂的水解作用。