论文部分内容阅读
月经周期是高等灵长类动物的生理特征,是子宫内膜在精密的雌孕激素调节下发生增殖、分化,在分泌晚期孕酮撤退时发生崩解脱落的周期性变化。子宫内膜这种周期性的崩解脱落以及其后的再生修复的更新过程,为妊娠做好了充足的母体准备。本论文以小/大鼠月经样模型为立足点,探讨子宫内膜崩解剥脱以及其后的再生修复过程,包括两个方面:COX-2/PGs调控HIF-1α作用子宫内膜崩解剥脱以及利用大鼠假孕月经样模型对子宫内膜生理修复初探。1、COX-2/PGs调控HIF-1α作用子宫内膜崩解剥脱。经典的月经发生假说认为,在月经分泌期晚期孕酮的撤退导致子宫中前列腺素(Prostaglandin,PG)水平的升高,进而促进了子宫螺旋小动脉的收缩,造成缺血缺氧,最终导致子宫内膜的崩解出血。环氧合酶(Cyclooxygenase,COX)作为PGs的限速合成酶,其亚型COX-2在妇科生殖中具有重要作用。课题研究小组前期结果显示,COX-2 mRNA和蛋白质在小鼠月经样模型子宫内膜崩解期高表达。本论文利用小鼠生理性孕酮撤退月经样模型,利用COX-2抑制剂Dup-697干预小鼠为实验组,溶剂组为对照组。孕酮撤退后0 h～24 h处死小鼠,获取子宫,H&E染色观察小鼠子宫内膜的崩解程度,表达谱芯片方法检测孕酮撤退后16 h时差异基因的表达情况。荧光实时定量PCR验证表达谱芯片HIF-1信号通路1l-6、PHD3、VGEFA、HIF-1α、NOS-2、Eno1和Filt-1mRNA的表达。通过免疫组化方法检测HIF-1αmRNA在孕酮撤退后16 h～24h的表达定位,通过western blot方法检测HIF-1 α蛋白在孕酮撤退后0 h～24 h的表达水平。且利用HIF-1α抑制剂2ME干预小鼠,H&E染色观察小鼠子宫内膜的崩解程度。结果显示,Dup-697处理的实验组,与对照组相比,小鼠子宫内膜崩解面积百分比显著降低(P<0.01),且实验组与对照组之间的差异随着崩解进程的推进而增大;表达谱芯片显示,Dup-697处理的实验组与对照组相比,在孕酮撤退16h时上下调基因分别为1873个和2017个,且HIF-1信号通路成员的差异基因变化活跃;验证发现在孕酮撤退0 h～24 h时Il-6、PHD3 和 VGEFA mRNA 均出现显著性下降(P<0.05),HIF-1αmRNA 在 0 h～16h出现显著性下降(P<0.05),在24h存在升高现象,且检测基因表达水平均在孕酮撤退0h～8h持续增加,在16h时达到最大值。变化趋势与在子宫内膜崩解剥脱的时期相符合。提示COX-2调控HIF-1α信号通路成员Il-6、PHD3、VGEFA和HIF-1α参与子宫内膜崩解剥脱;进一步,与对照组相比,COX-2抑制剂能够抑制HIF-1α的激活,且2ME能够显著抑制子宫内膜的崩解剥脱(P<0.05)。综上,COX-2/PGs能够激活HIF-1α参与子宫内膜的崩解剥脱;且在这过程中,缺氧环境下HIF-1α的PHD3泛素化途径可能受到抑制,使HIF-1α在细胞质内不易被降解以及作用于血管内皮细胞Il-6激活HIF-1α。2、利用大鼠假孕月经样模型对子宫内膜生理修复进行初探。子宫内膜功能层在崩解和脱落之后,会出现迅速的生理性修复过程,然而其中涉及的具体分子机制尚不明晰。由于相关临床标本难获得,个体差异大,取材部位不同等原因具有一定的局限性。小鼠子宫由于较小,不利于对子宫进行实验操作。本论文探讨建立大鼠假孕月经样模型,并初探子宫内膜的生理性修复过程。利用性成熟的雌鼠大鼠与去势后的雄鼠进行交配,见阴栓记为假孕第0天,分别在第4和5天开始人工诱导蜕膜化,在第6～8天切除卵巢,探讨蜕膜化诱导的起始和持续时间。进一步,在探讨合适的蜕膜化诱导的起始和持续时间之后,在卵巢切除32h、40 h、48 h、56h和64h颈椎脱臼处死大鼠,取出双侧子宫,利用石蜡切片和H&E染色方法观察子宫内膜的生理修复过程。并且与小鼠月经样模型修复进行比较。结果显示,在大鼠假孕第4天进行大鼠子宫蜕膜化操作、在假孕第7天进行雌性大鼠去势操作可以成功诱导蜕膜化且出现子宫内膜崩解出血现象;并发现大鼠的月经生理修复期从卵巢切除后32 h开始启动,在卵巢切除后64 h修复完全,修复过程共经历32h,期间大鼠子宫功能层基质细胞以及子宫腔上皮、腺上皮细胞逐渐增殖和分化;大鼠月经修复过程比小鼠修复起始晚8 h,修复时程长8 h。