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棉铃虫Helicoverpa armigera(Hübner)和烟青虫Helicoverpa assulta(Guenée)是我国广泛分布且同域发生的两大害虫,其两种性信息素主要组分相同,都是顺-11-16碳烯醛(Z11-16∶Ald)和顺-9-16碳烯醛(Z9-16∶Ald),但比例却完全相反,两种化合物的比例在棉铃虫是97∶3,而在烟青虫中却是7∶93。棉铃虫和烟青虫依靠特异性的性信息素感受机制来识别各自的性信息素组分,并进而维持生殖隔离。信息素结合蛋白(pheromone binding proteins,PBPs)可以溶解、转运性信息素分子,并具有一定的结合特异性。我们利用棉铃虫和烟青虫的性信息素组分比例差异明显的表型,研究了PBPs在棉铃虫和烟青虫感受性信息素过程中的作用,并为最终揭示PBPs的特异性及其工作机制提供了依据。 在进一步研究棉铃虫触角中与嗅觉感受相关的蛋白的过程中,我们在棉铃虫触角中发现了一种醛糖还原酶(aldo-keto reductase,AKR),怀疑其可能与性信息素的降解相关,因而详尽地研究了棉铃虫AKR的表达和功能,并第一次在昆虫中提出了其功能模型。 主要的研究结果如下: 1.RT-PCR显示PBPs在棉铃虫和烟青虫的触角中的表达模式一致。在mRNA水平上,PBP2在触角中的表达量最高,PBP1的表达量次之,PBP3的表达量最低。Western blot结果显示,PBPs在棉铃虫和烟青虫成虫中的表达模式没有差别,都主要在触角中表达。PBP1和PBP3除了在触角中表达外,还分别在棉铃虫和烟青虫的性信息素腺和翅膀中表达。PBP1和PBP2在雄性触角中的表达量明显高于其在雌性触角中的表达量。在蛋白质水平上,3个PBPs的表达量并没有明显差别。 2.利用荧光结合试验的方法对棉铃虫和烟青虫PBPs对性信息素组分,(Z)-11-hexadecenal(Z11-16∶Ald)和(Z)-9-hexadecenal(Z9-16∶Ald)以及其它4种结构类似物(Z)-11-hexadecenol(Z11-16∶OH)、(Z)-9-hexadecenol(Z9-16∶OH)、(Z)-11-hexadecenyl acetate(Z11-16∶OAc)和(Z)-9-hexadecenylacetate(Z9-16∶OAc)的结合能力进行了检测。结果显示棉铃虫和烟青虫的PBPs结合特性没有差别。PBP1对这6种化合物的结合能力都很好,且没有明显差别;PBP2对两种醇的结合能力最好,对两种性信息素化合物的结合能力也很强;PBP3特异性结合两种酯类化合物。 3.利用荧光结合试验的方法研究了化合物大小对PBPs结合能力的影响。结果表明,烟青虫PBP1特异性地结合含有13-15个碳原子的饱和线性醛类化合物和醇类化合物,而12-14个碳原子的线性饱和醛类化合物和醇类化合物是烟青虫PBP2的配体。虽然两种性信息素组分含有16个碳原子,但是各自含有一个顺式双键,与12-15个碳原子的饱和线型醛和醇的大小相似。这说明PBPs可以根据化合物的分子大小来特异性地结合某些化合物。 4.我们比较了烟青虫PBPs和缺失了C-末端的相应突变体在不同pH条件下结合能力的变化。随着pH的下降,PBPs的结合能力下降而相应的突变体的结合能力却没有明显变化,说明C末端在PBPs释放所结合的化合物的过程中起到非常重要作用。 5.RT-PCR结果显示,AKR在成虫的各个器官中都有表达,但在雌雄触角中表达量最高。Western blot结果显示,在蛋白质水平上,AKR在成虫的各个组织中也都表达,但在触角中的表达量最高,并且表达量并不随着成虫年龄的增长而变化。另外AKR在卵、幼虫期以及蛹期都有表达。 6.通过酶活性鉴定发现,AKR的最适底物是8-10个碳的醛类分子,而且对两种性信息素组分的还原能力很差。巯基化实验证明保持半胱氨酸的还原状态是AKR具备活性的前提条件。哺乳动物AKR的特异性抑制剂Sorbinil和Epalrestat对棉铃虫AKR的抑制作用并不强,说明昆虫AKR活性中心的大小或者氨基酸的排列与哺乳动物AKR的不一致,可能两者发挥还原作用的机制有不同。