一．概述 帕金森病是1817年英国医生James Parkinson描述的，以运动困难、肌肉强直、静止性震颤为特征的锥体外系疾病。多在50～65岁起病，呈进行性缓慢病程，主要病理变化是黑质纹状体区的多巴胺能神经元的变性、缺失，导致脑内多巴胺能神经递质相对减少，但其病因和发病机制尚不十分明确。目前，药物治疗、各种外科治疗(核团损毁术和DBS)只限于症状控制，并不能阻止帕金森病患者的病程进展。随着神经干细胞、分子克隆和重组基因技术的逐渐成熟，使神经干细胞基因治疗帕金森病的前景更加光明。 目前，PD基因治疗研究主要有两个方向：一是脑内导入酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase，TH)基因，通过TH基因的有效表达，提高脑内DA水平，以缓解PD症状；或导入各种神经营养因子或抗凋亡基因(bcl-2)、抗氧化基因(CuZnSOD和MnSOD)，改善黑质-纹状体的微环境，保护DA能神经元。二是联合基因治疗，即脑内导入两种以上的目的基因，希望同时达到上述目的。基因治疗的方法主要有：①体内直接转染法：把携带有治疗基因的载体(非病毒、病毒)直接注入到纹状体区，通过与周围细胞的粘附、吞饮、渗透、进入细胞内并与细胞内的染色体整合，或独自表达，表达产物的释放，起到生物药物泵的作用，发挥治疗作用，此方法简便、直接，但转染率低，易受到体内溶酶体中核酸酶的降解，靶向性差，基因表达程度低，可控性差，无法进行筛选和鉴定。②体外细胞介导法：体外细胞介导基因治疗结合基因转移技术和 弟一军医大学二零零一级博士学位论文导师:徐如祥教授脑内移植，可以在体外通过分子和生物化学技术对基因表达进行评估，首先是通过载体把目的基因转入到培养的靶细胞内，在体外进行筛选、鉴定，再进行扩增，然后移植于靶位点，转基因的表达功能通过生化技术和实验动物行为进行评估和监测。 帕金森病基因治疗的靶细胞有成纤维细胞，原代骨骼肌细胞、胶质细胞、胚胎中脑细胞、神经干细胞等。重组成纤维细胞、原代骨骼肌细胞虽然易于培养，能够发挥一定的治疗作用，但在脑内成活时间短、成活率低，不能与宿主细胞产生突触联系;胚胎中脑细胞、胚胎神经干细胞、成体神经干细胞存在非自体来源和来源有限的问题，限制了在帕金森病基因治疗上的应用。由于骨髓基质细胞容易获取，可以在体外大量扩增，而且可在一定条件下诱导成神经细胞并运用于自体移植，这为神经干细胞的应用提供了无限制的来源。骨髓源神经干细胞(NSCs一BMSCS)的开发和应用，克服了从脑组织获取神经干细胞的危险性和局限性，也避免了胎儿组织移植中存在的伦理、免疫排斥、来源有限等问题。以骨髓源神经干细胞为载体，进行基因转染、定向诱导神经干细胞为DA能神经元，替代变性的多巴胺能神经元，同时，神经干细胞分泌的神经营养因子则可以改善局部的微环境，起着营养支持的作用，从而可根本上遏制帕金森病的渐进病程。 本研究采用分子克隆、骨髓源神经干细胞培养和脑立体定向细胞移植等实验技术，将hTH基因分别构建入pEGFP一cZ和peDNA3.IHis真核表达载体中，构建了pEGFP一cZ一hTH和PcDNA3.IHis一hTH。同时，纯化提取pEGFP一cZ质粒，酶切鉴定后分别转入培养的骨髓源性神经干细胞，体外进行其基因表达情况的观察，证实成功表达后，将转染的骨髓源性神经干细胞定向注射入经右颈总动脉注射MPTP制作的偏侧恒河猴帕金森病模型的尾状核头部和黑质部位。移植后定期观察恒河猴的动作行为变化。5个月后行头部’“F一FDG PET、MRI和”9mrI’c一TRoDAf一lSPECT检查，分别观察细胞移植后脑内的代谢、结构和脑内DA能神经元的分布。最后，免疫组织化学观察移植细胞的分布情况。第7页第一军医大学二零零一级博士学位论文导师:徐条祥教授二.本实验的主要方法和结果:1.为适时观察基因在细胞内的表达，以户从VZ一TH为模板，PcR扩增，携带Eco班和BamHI双酶切位点的hTH目的片段，大小为1，500bp。 回收PcR产物与与pEGFP一cZ的双酶切片段连接，连接产物转化感 受态BL21，卡那霉素抗性筛选阳性克隆。提取质粒经酶切和测序鉴 定，结果显示:hTH目的片段测序结果与报道序列(gi:37 1 26)同源 性达100%;pEGFP一cZ一hTH酶切片段大小正确，说明已成功地将 hTH基因克隆到荧光表达载体pEGFP一cZ上。pEGFP一cZ为真核荧 光表达载体，5’端连接有报告基因即增强绿色荧光蛋白(enhance green fluorescent protein，EGFP)基因，EGFP在紫外光激发下可发强 绿色荧光，能较好的标示出细胞转染情况。2.为移植后跟踪移植细胞的迁移分布情况，以p认钱VZ一TH为模板，PCR 扩增携带KPul和xbal双酶切位点的hTH目的片段，大小为1，500bp。 回收peR产物与KPnl和Xbal双酶切peDNA3.lhis片段连接，连接 产物转化感受态大肠杆菌，氨节青霉素抗性筛选阳性克隆。提取质粒 经酶切和测序鉴定，结果显示:hTH目的片段测序结果与报道序列同 源性达100%;PcDNA3.lhis一hTH酶切片段大小正确，说明已成功地 将盯H基因克隆到真核表达载体PcDNA3 .lhis中。其中，PcDNA3.lllis