杜仲抗氧化功能成分的提取及分离纯化研究

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杜仲(Eucommia ulmoides Oliv.)是我国独有的名贵中药材,主要由树皮、叶、果实等器官组成。杜仲植物组织内含有丰富的天然活性成分,已从杜仲中已分离得到了约205种,具有降血压、降血糖血脂、预防骨质疏松、抗菌、抗炎、抗肿瘤、抗氧化等多种药理作用。杜仲翅果(由果仁和果皮组成)主要用于提取杜仲籽油,提取完杜仲籽油后用于提取杜仲胶,其残渣被弃掉或简单利用,实际上样品中含有丰富的具有生物活性与药用价值的天然活性成分,如桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸、绿原酸、黄酮类化合物等。因此,以去除果仁的杜仲翅果皮为原料进行天然活性成分的提取和纯化,变废为宝,不仅能够减少农业资源浪费,大幅度提高林农收入,还能摊薄杜仲胶、杜仲产品等的生产成本,促进我国杜仲产业可持续发展。1.为了增加桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸、绿原酸的得率,尽可能实现完全提取。以去除果仁的杜仲翅果皮为原料,考察了5种生物酶(酸性木聚糖酶、漆酶、中性木聚糖酶、半纤维素酶、碱性木聚糖酶)的提取效果,结果以酸性木聚糖酶用于酶解杜仲翅果皮的提取效果最佳。通过考察不同酶用量、酶解p H、酶解温度、酶解时间对酶解效果的影响,采用正交试验设计法对酶解条件进行优化,获得的最佳酶解条件为:酶用量6%、酶解p H 4.8、酶解温度45℃、酶解时间8 h,此条件下,桃叶珊瑚苷得率为53.57μg/g、京尼平苷酸得率为567.42μg/g、绿原酸得率为41.69μg/g,总得率为662.69μg/g,比不经任何酶解处理的样品高7.7倍。将以上最佳酶解工艺条件用于实际分步连续酶解试验中,结果发现,增加酸性木聚糖酶继续酶解,桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸、绿原酸的得率分别增加了7.45μg/g、63.97μg/g、6.93μg/g。2.为了全面考察微滤(MF)、超滤(UF)、纳滤(NF)、反渗透(RO)4种膜的分离纯化效果,以降低膜污染和提高有效成分的收率为前提,将主要起分离作用的微滤膜、超滤膜单独用或联用后事先处理杜仲翅果皮酶解提取液,然后分别与具有浓缩功能的纳滤膜、反渗透膜进行组合使用,考察微滤、超滤、微滤+超滤、微滤+纳滤、超滤+纳滤、微滤+超滤+纳滤、微滤+反渗透、超滤+反渗透、微滤+超滤+反渗透等9种处理方法对杜仲酶解提取液的“分离纯化”效果。采用熵权法计算主要评价指标的权重(Wj),并计算综合得分(Y),结果表明超滤法在3种分离方法中的综合得分最高,将3种分离方法分别与纳滤膜、反渗透膜联用后,结果以超滤+反渗透法的综合评分最高,超滤+反渗透法可作为杜仲翅果酶解提取液的最佳工序,该方法所得的蛋白质去除率为99.02%,淀粉去除率57.42%,果胶去除率50.16%,鞣质去除率52.15%,固形物去除率26.29%,桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸、绿原酸的收率分别为80.63%、79.18%、45.49%。膜分离处理后,样品的色泽度明显得到了改善,澄清度较高。3.在最佳分离纯化工序的基础上,考察料液温度、操作压力、操作频率、过膜时间、料液浓度、料液p H对超滤纯化工艺的影响,并采用Box-Behnken响应面法对超滤工艺进行优化,最佳条件为:料液温度35℃、操作压力0.5 MPa、操作频率35Hz、过膜时间42 min,在此条件下,桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸、绿原酸转移率和固形物去除率分别为93.54%、82.36%、58.15%、70.89%,与优化前相比,分别提高了1.55、1.32、1.66、1.58倍。4.为了考察膜分离法对样品的体外抗氧化活性的影响,在已建立的纯化工艺和最佳条件下制备样品,并测定它们的体外抗氧化活性,考察膜分离法杜仲提取物体外抗氧化活性的影响。与酶解提取液原液相比,超滤处理后,不同浓度杜仲提取物的ABTS自由基清除率、DPPH自由基清除率、羟自由基清除能力、超氧阴离子抑制能力均会降低,但将超滤的样品进一步经反渗透膜浓缩处理,其ABTS自由基清除率、DPPH自由基清除率、羟自由基清除能力、超氧阴离子抑制能力均高于超滤提取物,说明反渗透膜浓缩可以有效提高超滤提取物的抗氧化能力,且保持较高的抗氧化活性,进一步说明超滤+反渗透处理在杜仲酶解提取液体系的分离纯化中是可行的。
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