非洲猪瘟（African swine fever,ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）引起的一种急性、热性、接触性、高致死性传染病。自2018年我国首例非洲猪瘟被报道后,疫情快速蔓延,由于尚无有效疫苗,给生猪产业造成严重影响。早期诊断是ASF防控的关键,市场也急需针对ASF,快速、准确的早期诊断方法。ASFV编码超过200种蛋白,除主要结构蛋白外,还有非结构蛋白功能未知,这也阻碍了ASFV的深入研究。为进一步了解ASFV蛋白结构及功能特点,以期筛选出潜在的ASFV优势抗原,建立快速、准确的ASFV检测方法,为ASFV的有效防控奠定基础。本研究首先利用生物信息学方法对8个ASFV非结构蛋白（p H124R、p C129R、p K145R、p0174L、p E184L、p I329L、p MGF-360-14L、p NP419L）进行优势B细胞抗原表位以及结构特点的综合评价分析。其次通过合成目的基因,分别构建8个ASFV重组表达质粒载体,原核表达ASFV重组蛋白。结合ELISA方法将8个重组蛋白分别与ASFV阳性血清反应,分析反应原性,筛选优势ASFV重组蛋白后免疫小鼠分析其免疫原性。最后利用棋盘式滴定法确定筛选出优势蛋白抗原的最佳的反应条件,建立间接ELISA检测方法,并从敏感性、稳定性、特异性、符合率等方面开展评价。结果显示:（1）ASFV p H124R、p C129R、p K145R、p O174L为稳定亲水蛋白,p E184L、p MGF-360-14L、p I329L、p NP419L为不稳定亲水蛋白。8个蛋白氨基酸序列主要由α螺旋与β折叠组成,p NP419L的序列组成中β转角与无规则卷曲占比较高。p I329L为跨膜蛋白,具有信号肽结构。p E184L与p NP419L各有4个优势B细胞抗原表位,p H124R、p K145R、p I329L蛋白分别有3个优势B细胞抗原表位,p H129R、p O174L、p MGF-360-14L蛋白分别有2个优势B细胞抗原表位。（2）构建了8个ASFV蛋白（p ET-28a-H124R、C129R、K145R、0174L、E184L、MGF-360-14L、I329L、NP419L）的重组质粒,成功纯化了6个为可溶性表达的蛋白（p H124R、p C129R、p K145R、p O174L、p E184L、p NP419L）、2个为包涵体表达蛋白（p MGF-360-14L、p I329L）,蛋白纯度均在90%以上。ASFV阳性血清反应原性结果显示8个ASFV蛋白的OD值处于0.522-1.095之间,其中p E184L蛋白的OD值为1.095,表明p E184L蛋白具有良好的反应原性。免疫小鼠后测得抗p E184L蛋白血清的效价为1:64000,表明其具备良好的免疫原性。（3）ASFV pE184L蛋白间接ELISA方法的最优反应条件为:最佳包被液为碳酸盐缓冲液（p H:9.6）、最佳包被时间为1 h、p E184L抗原最佳包被浓度为1.25 ng/u L,最佳封闭液及封闭时间为:5%脱脂乳、37℃封闭1 h,血清样本最佳稀释度为1:200、孵育15 min,酶标二抗最佳稀释度为1:10000、孵育15 min,显色20 min,Cut off值为0.123。建立的ASFV p E184L蛋白间接ELISA方法批内与批间重复实验的变异系数均小于10%,且不与HCV、PRRSV、GBV、PCV2等病毒的阳性血清发生交叉反应。与商品化ELISA试剂盒的符合率实验结果表明,在161份临床样品中,ASFV p E184L蛋白间接ELSIA检出阳性83份,阴性78份,总符合率为96.27%。综上,本实验利用生物信息学方法对8个ASFV非结构蛋白特点进行综合分析,通过构建ASFV重组蛋白的原核表达载体,成功制备8个ASFV非结构蛋白,结合生物信息学的免疫原性分析和与ASFV阳性血清的反应原性分析结果,筛选p E184L蛋白作为优势抗原,将其免疫小鼠后的血清效价检测结果显示,ASFV p E184L蛋白具有较好的免疫原性。基于上述针对p E184L蛋白的综合评价结果建立了ASFV p E184L蛋白间接ELISA检测方法,该方法具有良好的敏感性、特异性、稳定性,与商品化ASFV ELISA试剂盒相比具有良好的符合率。本研究为潜在的ASFV优势抗原的筛选、ASF早期快速诊断方法的建立及ASF的有效防控提供了基础。