【摘 要】
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天然产物的生物合成新机制对于理解大自然如何利用简单起始单元产生复杂结构的次级代谢产物、挖掘发现可催化特殊化学反应的新颖酶催化机制、运用组合生物学改造具有成药价值的天然产物是十分重要的。Curvulamine（1）是从海洋白姑鱼肠道来源的真菌Curvularia sp.IFB-Z10中分离得到的具有良好抗菌活性的一类新骨架吲哚里西啶生物碱,其结构独特之处在于由两个未曾报道的含有吡咯环的结构单元7和含
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天然产物的生物合成新机制对于理解大自然如何利用简单起始单元产生复杂结构的次级代谢产物、挖掘发现可催化特殊化学反应的新颖酶催化机制、运用组合生物学改造具有成药价值的天然产物是十分重要的。Curvulamine（1）是从海洋白姑鱼肠道来源的真菌Curvularia sp.IFB-Z10中分离得到的具有良好抗菌活性的一类新骨架吲哚里西啶生物碱,其结构独特之处在于由两个未曾报道的含有吡咯环的结构单元7和含有吲哚里西啶的结构单元8拼接而成,其中结构单元7可以转化为结构单元8。根据同位素标记的前体投喂实验,我们提出curvulamine的生物合成应该与聚酮合成酶（polyketide synthase,缩写为:PKS）和8-氨基-7氧壬酸合成酶（8-amino-7-oxononanoate synthase,缩写为:AONS）有关,但其具体分子机制仍然没有得到阐明。本论文主要阐释了curvulamine的生物合成途径,发现了一种新的吲哚里西啶生物碱骨架的构建方式,并首次发现了COX15会对微生物次级代谢产物的结构多样性产生重要影响。共分四章,主要内容如下:第一章主要对微生物天然产物发现的新策略及吲哚里西啶生物碱的生物合成研究进展做了简要综述。第二章主要对curvulamine生物合成机制进行了探索。我们首先对Curvularia sp.IFB-Z10进行全基因组测序,通过生物信息学分析、q RT-PCR和基因敲除等技术手段确定了其生物合成基因簇,主要包括cur A（PKS）、cur B（AONS）、短链醇脱氢酶或还原酶cur C（short chain alcohol dehydrogenase/reductase）、核黄素依赖的氧化还原酶cur D（FAD-dependent oxidoreductase）、转运蛋白cur E（transporter）、细胞色素c组装蛋白Cox15p cur G（cytochrome c assembly protein Cox15p）和转录调控因子cur G（transcriptional regulation factor）。根据A.oryzae NSAR1的异源表达、cur D体外酶催化实验和cur C基因敲除结果提出了curvulamine的可能的生物合成途径:cur A和cur B首先共同催化获得中间体5,随后5被cur D环氧化成中间体6,推测中间体6被cur C还原脱水成中间体7,随后7会自发形成含吲哚里西啶骨架的中间体8,中间体7和8通过后续的Michael加成、环氧化和脱水等后修饰过程,最终形成了curvulamine。中间体7和8是构建curvulamine生物碱的两个关键结构单元。中间体8的形成代表一种新的吲哚里西啶生物碱骨架的构建方式。第三章主要发现细胞色素c氧化酶组装蛋白Cox15p（cur G）对微生物次级代谢产物的结构多样性有重要影响。COX15对Heme A的生物合成中起到重要作用,但从未有文献报道敲除COX15会影响微生物的次级代谢产物的结构多样性。我们对突变株（Δcur G）进行了80 L发酵,结果分离得到15个新生物碱,更为重要的是化合物17、18和20显示了较好的抗菌活性,这说明Δcur G不仅可以增加生物碱结构的多样性,同时也通过改变构效关系产生活性更好的天然产物。对突变株（Δcur G）中cur A-F的m RNA表达水平进行了q RT-PCR的检测,发现它们的m RNA表达水平相对于野生型均有升高。同时突变株（Δcur G）与过表达转录因子cur F菌株（OE::cur F）的发酵效果很相似,这都表明cur G对整个生物合成基因簇表达起到一定的负调控作用。第四章进行了总结和展望。Curvulamine生物合成机制的研究结果表明结构新颖、活性良好的天然产物往往会蕴含着新颖的生物合成机制,应受到人们重视和关注。本文对curvulamine类生物碱的生物合成机制进行了研究,发现一种新的吲哚里西啶生物骨架的构建方式,同时发现了cur G（COX15）影响了Curvularia sp.IFB-Z10中生物碱结构多样性,这种现象在其他微生物次级代谢的调控中尚未见报道。本文所发现的吲哚里西啶生物碱的生物合成机制为未来通过基因组挖掘、代谢途径的突变合成等手段获得此类新颖结构的生物碱提供了思路,也后续药物研发,寻找抗菌药物先导化合物提供了借鉴。
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