论文部分内容阅读
背景:可变剪接是一种进化上高度保守的细胞转录后过程,可驱动真核生物中转录组和蛋白质组的多样性。越来越多的证据表明,可变剪接的异常转变与癌症中诸多恶性特征密切相关,是肿瘤进展和治疗干预的重要标志物。胶质瘤以其高度异质性和临床进展迅速而闻名,是成人中最常见同时最具侵袭性的颅内原发性恶性肿瘤。研究表明,在胶质瘤中异常剪接产物作为致癌驱动因素发挥关键作用,导致肿瘤内高度异质性以及恶性表型转变。近年来,长链非编码RNA(Long noncoding RNA,lncRNA)作为一类新兴的表观遗传调控分子,在肿瘤发生和恶性进展中发挥重要驱动作用。然而在胶质瘤异常可变剪接调控方面,大多数lncRNA的功能和生物学意义目前仍然难以捉摸。因此,深入探索lncRNA调控可变剪接的分子机制对于制定新的肿瘤靶向治疗策略至关重要,并有利于改善胶质瘤患者预后。本研究联合胶质瘤组织lncRNA表达谱芯片与RIP免疫共沉淀(RIP-seq)测序,筛选出可能与胶质瘤可变剪接密切相关的lncRNALINREP(Long intergenic noncoding RNA for ELAVL1 and PTBP1)。通过体内外功能实验验证LINREP对胶质瘤细胞恶性生物学行为的影响,明确LINREP与可变剪接相关蛋白的相互作用关系及对下游靶基因的调控作用,在lncRNA/结合蛋白/科变剪接层面探究LINREP调控胶质瘤进展的分子机制。方法:本研究联合lncRNA组织表达谱芯片与RIP-seq测序,筛选在胶质瘤/瘤旁/正常脑组织中差异表达并与剪切因子PTBP1特异性结合的lncRNALINREP。通过原位杂交(ISH)和实时定量PCR(RT-qPCR)技术检测胶质瘤组织样本及胶质瘤细胞系中LINREP的表达情况。利用荧光原位杂交(FISH)和RNA核质分离技术明确LINREP在胶质瘤细胞中的分布及亚细胞定位。通过RIP、RNA pull down、FISH-免疫荧光共定位实验进一步明确LINREP与靶蛋白的结合能力。通过CCK-8、EdU、Transwell及细胞划痕实验探究胶质瘤中LINREP对细胞增殖、迁移及侵袭能力的调控功能。通过建立LINREP过表达裸鼠模型,观察LINREP在体内条件下对胶质瘤细胞增殖活性的影响。在胶质瘤细胞系中敲除或过表达LINREP,通过Western Blot实验检测LINREP对PTBP1蛋白表达的影响,进一步采取CHX、MG132加药及体外泛素化实验明确LINREP是否调控PTBP1蛋白稳定性。RNA-seq分析在胶质瘤中LINREP和PTBP1调控的可变剪接类型,筛选出LINREP和PTBP1共同调控的最显著变化的可变剪接靶基因,并验证LINREP、PTBP1与靶基因可变剪接产物的调控关系。在胶质瘤细胞中敲低ELAVL1(又称为HuR),通过RT-qPCR分析HuR对LINREP表达的影响。通过RNA甲基化免疫共沉淀(MeRIP)技术检测LINREP是否被6-甲基化腺嘌呤(N6-methyladenosine,m6A)修饰,通过RT-qPCR、ActD加药实验明确HuR是否通过依赖m6A修饰方式增强LINREP的稳定性。结果:(1)筛选和鉴定与PTBP1相互结合的lncRNA联合RIP-seq和lncRNA芯片分析,筛选具有差异表达并与PTBP1特异性结合的lncRNA LINREP,进一步实验证实LINREP与PTBP1/HuR蛋白复合体结合。LINREP在高级别胶质瘤中显著上调,且高表达组患者总生存(Overall survival,OS)较差。(2)LINREP促进胶质瘤细胞的恶性生物学行为LINREP敲除后,胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力均明显降低,而过表达LINREP后胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力显著增强。荷瘤裸鼠实验中,LINREP过表达组荷瘤鼠颅内瘤体体积更大,且OS明显缩短。(3)LINREP参与调控PTBP1蛋白的稳定性通过CHX加药、MG132加药、体外泛素化实验证实LINREP通过抑制PTBP1的泛素-蛋白酶体降解途径,延长PTBP1蛋白的半衰期。(4)LINREP通过与PTBP1结合调控RTN4的可变剪接RNA-seq测序显示LINREP和PTBP1主要调控转录本的外显子跳跃突变,进一步实验证实LINREP促进了 RTN4的第3个外显子跳跃突变。(5)LINREP通过与PTBP1相互作用促进胶质瘤进展体外条件下,PTBP1过表达能够显著逆转LINREP敲低对胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭能力的抑制作用。体内条件下,PTBP1敲低后显著逆转了 LINREP过表达对胶质瘤细胞生长的促进作用并延长了荷瘤裸鼠的存活时间。(6)HuR通过依赖m6A甲基化修饰方式增强LINREP的稳定性MeRIP实验证实LINREP存在高水平的m6A甲基化修饰,甲基转移酶METTL3可显著增强LINREP的m6A甲基化修饰,从而促进HuR与m6A修饰的LINREP结合,延长其RNA半衰期。结论:本研究阐明了 LINREP通过抑制PTBP1的泛素-蛋白酶体降解途径,增强PTBP1蛋白稳定性,从而促进PTBP1介导的RTN4第3个外显子的跳跃突变,最终促进胶质瘤的恶性进展。此外,METTL3介导LINREP的m6A甲基化修饰,促进HuR与LINREP的结合,从而在转录后水平增强LINREP的稳定性。