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背景与目的:炎症性肠病（Inflammatory bowel disease,IBD）是一类慢性非特异性炎性疾病。随着人民生活水平不断提高,我国的IBD发病率逐年升高。IBD发生发展受饮食、环境、遗传等多种因素影响。因此,研究IBD发生发展的分子机制,对于该类疾病的治疗具有重要的意义。Receptor-interacting protein kinase 1（RIP1）是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,在肠上皮细胞中表达丰富,且参与调控细胞存活（cell survival）、凋亡（apoptosis）和程序性坏死（necroptosis）等重要的细胞行为。已有研究表明,IBD患者的上皮屏障功能常受损,而完整的肠上皮结构是维持肠道功能稳态的关键因素。生理状态下,肠上皮细胞处于快速的动态平衡中,5-7天即可完成一次更新。肠上皮细胞增殖、死亡必须受到严格调控,才能维持肠上皮结构和屏障功能的完整性。本课题中,我们旨在回答以下两个问题:一、RIP1对肠上皮细胞增殖、分化的影响;二、敲低RIP1是否影响结肠炎小鼠肠上皮损伤后的修复。本课题的研究将进一步阐明RIP1在结肠炎发生后上皮屏障修复中的作用机制,为IBD治疗提供借鉴。研究方法:1.采用knockout first技术构建RIP1敲低小鼠模型（RIP1+/-）。采集RIP1+/-小鼠空肠、回肠和结肠组织,通过石蜡切片和H＆E染色检测RIP1+/-小鼠肠道形态。通过免疫组化以及qPCR技术检测活跃干细胞和静息干细胞标记基因Lgr5和Bmi1的表达情况,分析RIP1敲低对肠上皮细胞增殖和分化的影响。2.建立小鼠结肠炎模型:RIP1+/-和野生型小鼠饮用含有3%DSS的饮用水7天后,换成普通水2天,以诱导建立小鼠结肠炎模型。小鼠经颈椎脱臼处死后,测量结肠长度。收集整段结肠,分离并收集结肠上皮细胞,并提取肠上皮细胞总RNA进行qPCR实验,分析实验组与对照组小鼠肠上皮细胞中增殖相关基因的表达。收集实验组与对照组小鼠的整段结肠组织制作石蜡切片,通过H＆E染色和免疫组化等实验手段分析上皮细胞增殖、细胞类型标记基因的表达和定位情况。分析RIP1敲低小鼠是否对DSS诱导的结肠炎敏感。3.分离RIP1+/-和野生型小鼠的肠隐窝,进行类器官培养。收集类器官,提取总RNA进行qPCR实验,分析细胞增殖、分化以及NF-κB信号通路相关基因的表达情况。分析RIP1敲低对小鼠肠类器官增殖和分化的影响。4.构建RIP1敲低的L929细胞系,采用PI/Hoechst双染方法,分析RIP1敲低对细胞存活的影响。在培养基中加入zVAD,或程序性坏死抑制剂Necrostain-1（Nec-1）,采用细胞实时成像分析及Western blot等手段,综合分析RIP1在调控L929细胞死亡方式中的作用。结果:本课题采用knockout first技术,构建了全身性RIP1敲低小鼠模型。结果表明,RIP1敲低小鼠回肠和结肠上皮细胞的RIP1蛋白表达量为野生型小鼠的46.98 ±9.79%和60.32 ± 8.10%。回肠和结肠H＆E染色结果表明,RIP1+/-小鼠的肠上皮结构完整,无免疫细胞浸润。绒毛中ChgA+和Muc2+标记的内分泌和杯状细胞数量、隐窝中干细胞标记基因Lgr5和Bmi1表达均与野生型小鼠无差异。但是,RIP 1+/-小鼠的绒毛和隐窝长度均缩短,隐窝内Ki67+细胞数量显著减少。给RIP1+/-和野生型小鼠饮用3%DSS建立结肠炎模型,结果显示RIP1+/-小鼠体重下降更明显,结肠长度更短;隐窝内Ki67+细胞大量减少,且增殖和肠干细胞标记基因表达均显著下降;绒毛中ChgA+细胞数量增加,Muc2+细胞标记基因表达下降。小鼠肠类器官水平的研究得到了类似的结果:和野生型肠类器官相比,RIP1+/-肠类器官的增殖、肠干细胞及各类成熟细胞标记基因的表达均下降。本课题还检测了 NF-κB信号通路中的重要分子,结果显示,在RIP1+/-肠类器官中,NF-κB信号相关分子如IKKβ和P65的表达均下降。L929细胞是研究细胞凋亡和程序性坏死的适合细胞系。本课题首先构建了 RIP1敲低的RIP1KDL929（P1）细胞系。该细胞系中,PI+细胞比例显著增加,表明RIP1是维持L929细胞存活所必需的。用zVAD和Nec-1处理RIP1KD L929（P4）细胞和对照组细胞,Nec-1可以完全抑制对照组细胞死亡,但只能部分抑制RIP1 KDL929（P4）细胞死亡,说明RIP1敲低后,L929细胞可能存在除程序性坏死以外的细胞死亡方式。结论:本课题成功构建了 RIP1敲低小鼠模型。与RIP1全敲和RIP1肠上皮特异性敲除小鼠相比,RIP1+/-小鼠整体上与野生型小鼠无差异,且可存活可育。在生理状态下,RIP1维持回肠上皮增殖,但不影响细胞干性和分化,RIP 1+/-小鼠肠上皮结构完整,无炎症反应。但当肠上皮损伤之后,RIP 1+/-小鼠结肠的增殖能力进一步下降,肠上皮细胞干性下降并出现细胞分化障碍,从而阻碍肠上皮损伤后修复。本课题的研究还表明RIP1可能通过NF-κB通路调控肠上皮细胞增殖。在细胞模型中,本课题的研究还显示RIP1在维持L929细胞存活和细胞死亡方式的转变中具有重要作用。