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氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)因其快速不完全氧化糖和醇等化合物的能力,被广泛用于5-酮基-D-葡萄糖酸、二羟基丙酮和2-酮基-L-古龙酸(维生素C前体)等的生产中,具有重要的应用价值。启动子作为基因转录调控的重要元件,是代谢工程改造菌体提高生产性能的重要分子生物学工具。目前国内外在G.oxydans启动子的筛选方面的研究较少,使得适用于G.oxydans中代谢工程改造的启动子相对有限。本文基于新一代高通量转录组测序技术(next generation high throughput RNA-Seq technology),通过在工业菌株G.oxydans WSH-003全基因组水平上进行筛选,得到一系列梯度强度组成型启动子。使用其中最强的启动子Pdnak过量表达基于RNA-Seq确定的D-山梨醇脱氢酶关键基因sld AB1,证明了筛选的Pdnak高强度起始转录效果,并显著缩短了发酵时间、提高了L-山梨糖的产量。本论文主要研究成果如下:(1)使用高通量RNA-Seq技术,获得G.oxydans发酵培养5个时期的基因表达(转录)水平。使用1-L发酵罐培养细胞,构建了4 h、8 h、12 h、20 h和40 h共5个时间点样品的发酵培养菌体的RNA-Seq转录组文库。5个样品经过高通量测序后得到高质量的测序数据,通过生物信息学分析,得到全基因组范围的基因转录水平值FPKM(Fragments Per Kilobase of exon model per Million mapped reads)。统计显示,每个样品中约50%基因的FPKM值在32-320之间,约25%的基因FPKM在320-10,000之间,约25%的基因FPKM在1-32之间,并存在少量异常高和低表达的基因。根据RNA-Seq测序结果,并结合G.oxydans WSH-003基因组序列信息,确定了菌株中D-山梨醇脱氢酶关键基因为sld AB1和sld SLC。(2)根据RNA-Seq的测序结果,使用加强绿色荧光蛋白基因(egfp)为报告基因,筛选获得包括高强度启动子Pdnak在内的梯度强度组成型启动子。基于RNA-Seq获得的转录本FPKM值,在全基因组水平挑选得到dnak、tuf和mdh等分属高、中和低表达的组成型基因。并构建以egfp为报告基因的启动子荧光检测重组菌,通过使用荧光定量PCR和荧光酶标仪检测egfp基因的转录水平和蛋白表达水平,以确定各启动子强度。最终筛选得到包括一个最强启动子Pdnak在内的高、中和低3组梯度强度的组成型启动子。以文献报道的强启动子Ptuf为参考,Pdnak和Phistone为高强度启动子,Ptuf、Poutmem和Psod为中等强度启动子,Pmdh和Phsp90为低强度启动子,各启动子的强度关系为,Pdnak:Phistone:Ptuf:Poutmem:Psod:Pmdh:Phsp90=10.0:2.5:1.0:0.9:0.8:0.2:0.1。(3)验证所筛选出最强启动子Pdnak的起始转录效果,并实现D-山梨醇脱氢酶关键基因sld AB1在G.oxydans WSH-003中的过量表达。本研究分别构建了高强度启动子Pdnak和对照启动子Ptuf的D-山梨醇脱氢酶关键基因sld AB1的过表达重组菌G.oxydans p BBR-Pdnak-sld AB1和G.oxydans p BBR-Ptuf-sld AB1。荧光定量PCR的结果表明,和对照菌相比,G.oxydans p BBR-Pdnak-sld AB1中sld AB1基因的转录水平得到很大提高,分别是G.oxydans p BBR-Ptuf-sld AB1和野生菌G.oxydans WSH-003的2.2倍和5.1倍。同时,摇瓶发酵结果表明,和野生菌相比,过表达菌株G.oxydans p BBR-Pdnak-sld AB1的D-山梨醇转化时间缩短了33.3%、L-山梨糖的产量提高了11.2%。