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我国作为一个农业大国，生猪饲养在我国农业生产中占有举足轻重的地位，关系到国计民生。猪流行性腹泻是目前世界上严重危害养猪业健康发展的一种接触性肠道传染病，其特征表现为腹泻、呕吐、脱水。预防和防治猪流性腹泻病最有效的方法是接种疫苗。由于分子生物学和植物转基因工程技术的快速发展，使得转基因植物疫苗的优势更加突出，包括成本更低廉、安全性更高、操作更简便等。转基因外源蛋白质遗传相对稳定，可作为口服疫苗或饲料添加剂，具有广阔的发展前景。本研究通过植物双元表达载体和农杆菌介导法将猪流行性腹泻病毒抗原基因转入番茄植株，免疫原基因在番茄基因组内表达，然后对小鼠和仔猪进行免疫实验，通过产生的抗体水平高低及免疫原性研究，为猪流行性腹泻病毒植物转基因疫苗的研制和生产提供有力理论支持。
由于转基因外源蛋白质遗传相对稳定，可作为口服疫苗或饲料添加剂，发展前景广阔，本文主要研究内容是构建植物表达载体、病原基因在番茄内整合表达和动物免疫实验。其结果如下：
1)构建了猪流行性腹泻病毒HeNPEDV_01株结构蛋白S1基因的植物双元表达载体pBI121/S1B和pBI121/S1D，S1B和S1D抗原区基因组启始密码子为ATG，S1B共编码720个核苷酸；S1D共编码1140个核苷酸，通过核苷酸序列比对分析，S1B和S1D基因序列与HeNPEDV_01的核苷酸同源性分别为100%和99.8%。
2)转基因植物番茄表达体系的构建。根据番茄密码子偏好性，对外源目的抗原基因S1B和S1D进行序列优化，同时在片段5′端引入内质网引导多肽序列SEKDEL，提高抗原蛋白在番茄的累积量，在3′端添加Kozak序列，提高翻译效率。本文以花椰菜花叶病毒CaMV35S为启动子，成功构建了猪流行性腹泻病毒S1基因pBI121/S1B和pBI121/S1D转基因番茄双元表达载体。
3)转基因植物番茄转化系统的优化及检测。植物体细胞具有较强的再生分化能力，并且再生出芽长成完整的植株。本实验在现有研究的基础上优化了番茄转化条件，在MS培养基中加入IAA0.1mg/L和ZT1.0mg/L，农杆菌与子叶侵染3min～5min。将转化的番茄植株通过酶联免疫检测，pBI121/S1B卡那抗性植株阳性约为40%，pBI121/S1D卡那抗性植株阳性为25%；实验表明猪流行性腹泻病毒的免疫原基因S1B和S1D整合到番茄基因组中，表达的外源目的蛋白具有免疫原性。
4)动物免疫实验。将含有抗原基因的番茄叶片蛋白提取液免疫小鼠，首次免疫10d后无PEDV抗体，第二次免疫10d后ELISA检测抗体水平并出现第一个高峰，第三次免疫21d后ELISA检测抗体水平显著提高并出现第二个高峰，其中pBI121/S1B免疫21d后血清效价最高1:64，强毒攻击免疫保护率为80%，pBI121/S1D免疫21d后血清效价最高1:128，保护率达72%。
5)动物回归实验。通过研制的含有抗原转基因番茄疫苗免疫仔猪实验，转基因番茄疫苗能够抵抗病毒的感染，提高仔猪的存活率；通过不同病毒对仔猪感染实验可知，PRV,PRRS和TGE对病毒复制的影响与PBS类似，而实验组S1B、S1D与PEDV疫苗的病毒滴度却相对较低。感染21d后脾脏、肝脏、肺、唾液腺病毒子代粒子相对于对照组表达的要依次低1000、2000、4000、15000倍，转基因番茄疫苗免疫的要依次低100、200、800、1000倍，因而，猪流行性腹泻病毒S基因的S1B和S1D体内能够刺激机体产生免疫反应，抵抗病毒的感染。
综上所述，本文成功构建了猪流行性腹泻病毒S基因pBI121/S1B和pBI121/S1D转基因番茄双元表达载体，并用根癌农杆菌GV3101成功转染植物，培育了转基因番茄植株。并且对根癌农杆菌GV3101植物表达系统进行了试验条件优化，提高了转基因番茄的转化率。用含有抗原的转基因番茄叶片免疫小鼠和仔猪试验，试验小鼠和仔猪体内都具有良好的免疫原性，说明转基因番茄可以在体内诱导局部免疫应答和系统免疫应答，为规模化生产PEDV转基因植物可饲疫苗提供理论支持。
由于转基因外源蛋白质遗传相对稳定，可作为口服疫苗或饲料添加剂，发展前景广阔，本文主要研究内容是构建植物表达载体、病原基因在番茄内整合表达和动物免疫实验。其结果如下：
1)构建了猪流行性腹泻病毒HeNPEDV_01株结构蛋白S1基因的植物双元表达载体pBI121/S1B和pBI121/S1D，S1B和S1D抗原区基因组启始密码子为ATG，S1B共编码720个核苷酸；S1D共编码1140个核苷酸，通过核苷酸序列比对分析，S1B和S1D基因序列与HeNPEDV_01的核苷酸同源性分别为100%和99.8%。
2)转基因植物番茄表达体系的构建。根据番茄密码子偏好性，对外源目的抗原基因S1B和S1D进行序列优化，同时在片段5′端引入内质网引导多肽序列SEKDEL，提高抗原蛋白在番茄的累积量，在3′端添加Kozak序列，提高翻译效率。本文以花椰菜花叶病毒CaMV35S为启动子，成功构建了猪流行性腹泻病毒S1基因pBI121/S1B和pBI121/S1D转基因番茄双元表达载体。
3)转基因植物番茄转化系统的优化及检测。植物体细胞具有较强的再生分化能力，并且再生出芽长成完整的植株。本实验在现有研究的基础上优化了番茄转化条件，在MS培养基中加入IAA0.1mg/L和ZT1.0mg/L，农杆菌与子叶侵染3min～5min。将转化的番茄植株通过酶联免疫检测，pBI121/S1B卡那抗性植株阳性约为40%，pBI121/S1D卡那抗性植株阳性为25%；实验表明猪流行性腹泻病毒的免疫原基因S1B和S1D整合到番茄基因组中，表达的外源目的蛋白具有免疫原性。
4)动物免疫实验。将含有抗原基因的番茄叶片蛋白提取液免疫小鼠，首次免疫10d后无PEDV抗体，第二次免疫10d后ELISA检测抗体水平并出现第一个高峰，第三次免疫21d后ELISA检测抗体水平显著提高并出现第二个高峰，其中pBI121/S1B免疫21d后血清效价最高1:64，强毒攻击免疫保护率为80%，pBI121/S1D免疫21d后血清效价最高1:128，保护率达72%。
5)动物回归实验。通过研制的含有抗原转基因番茄疫苗免疫仔猪实验，转基因番茄疫苗能够抵抗病毒的感染，提高仔猪的存活率；通过不同病毒对仔猪感染实验可知，PRV,PRRS和TGE对病毒复制的影响与PBS类似，而实验组S1B、S1D与PEDV疫苗的病毒滴度却相对较低。感染21d后脾脏、肝脏、肺、唾液腺病毒子代粒子相对于对照组表达的要依次低1000、2000、4000、15000倍，转基因番茄疫苗免疫的要依次低100、200、800、1000倍，因而，猪流行性腹泻病毒S基因的S1B和S1D体内能够刺激机体产生免疫反应，抵抗病毒的感染。
综上所述，本文成功构建了猪流行性腹泻病毒S基因pBI121/S1B和pBI121/S1D转基因番茄双元表达载体，并用根癌农杆菌GV3101成功转染植物，培育了转基因番茄植株。并且对根癌农杆菌GV3101植物表达系统进行了试验条件优化，提高了转基因番茄的转化率。用含有抗原的转基因番茄叶片免疫小鼠和仔猪试验，试验小鼠和仔猪体内都具有良好的免疫原性，说明转基因番茄可以在体内诱导局部免疫应答和系统免疫应答，为规模化生产PEDV转基因植物可饲疫苗提供理论支持。