由于日益严重的水体富营养化和全球气候变化，人类和动物暴露于蓝藻水华产生的蓝藻毒素(cyanotoxins)已成为一个日益严重的全球性问题。在蓝藻毒素中，微囊藻毒素(microcystins，MCs)是一类分布广、毒性大的环状七肽毒素，其具有肝毒性和促肿瘤活性，是最常见的，也是最危险的蓝藻毒素之一，这些蓝藻毒素是有效的肿瘤促进剂(IARC2B类致癌物)。有流行病学研究表明，MCs是原发性肝癌(PLC)高发的危险因素之一。低剂量或高剂量的MC-LR的慢性或急性暴露可激活细胞凋亡途径，长期暴露于低浓度的MC-LR中会增加患癌症的风险。现有研究表明，microRNAs(miRNAs)与很多毒物的毒性有关，在环境毒理学中受到了极大地关注。miRNAs的表达失调可能导致多种毒物相关疾病的发生。miRNAs可能参与许多生物学过程，包括细胞凋亡、免疫保护、神经系统发育和癌症发病机制等。此外，许多研究报告表明，miRNAs可能在细胞对MC-LR暴露的反应中发挥关键作用。但是在毒理学领域，关于miRNAs与MC-LR毒性之间的关系还知之甚少。本研究选择通过高通量测序筛选与MC-LR肝毒性相关miRNAs，并通过生物信息学分析和预测目的miRNAs与MC-LR肝毒性的生物学过程以及信号通路的关系；同时，对筛选的目标miRNAs在MC-LR肝毒性中的表达以及作用的分子机制进行研究，以期揭示MC-LR致肝炎、肝癌的分子机制，并发现MCs毒性的分子生物标记物，为肝炎、肝癌药物靶点发现提供理论支持。本实验获得以下几方面的结果：
　　(1)MC-LR暴露对白鲢肝脏miRNAs表达谱的影响
　　为筛选MC-LR诱导的肝毒性作用中差异表达的miRNAs，本研究采用smallRNA转录组测序分析的方法进行研究。高通量测序结果显示，在MC-LR(腹腔注射浓度为50μg/kg和200μg/kg)暴露白鲢24h后，与对照组相比，处理组白鲢的肝脏分别有53个miRNAs和319个miRNAs的表达发生了显著变化。与50μg/kg处理组相比，200μg/kg处理组中白鲢肝脏203个miRNAs的表达显著上调，而163个miRNAs的表达下调。此外，本研究发现与对照组相比，MC-LR暴露可促进miR-2187-3p、miR-2779、miR-2478、miR-16、miR-144-5p、miR-181a-3p、miR-223、miR-451和miR-499的表达水平，而miR-146、miR-92、miR-203和miR-98的表达水平受到了抑制。本实验又进一步通过qPCR 结果证实了以上结果，表明这些miRNAs可能与MC-LR的肝毒性有关。随后通过生物信息学针对差异表达的miRNAs通过靶基因预测软件进行靶位点确认，并对靶位点所在基因的GO功能注释以及KEGGpathway注释。GO富集分析表明，这些靶基因与代谢和细胞生物学过程相关。此外，KEGG通路分析表明，肝脏差异表达miRNAs的靶基因主要参与了胰岛素信号转导通路、PPAR信号转导通路、mRNA监测通路、Wnt信号通路和转录异常等途径。
　　(2)MC-LR暴露对白鲢不同组织4个miRNAs表达的影响
　　通过高通量测序结果分析，筛选出miR-16、miR-181a-3p、miR-223和miR-451这个miRNAs。因此，我们检测了这4个miRNAs在MC-LR暴露后白鲢不同组织(肝、脾、肾、肠)中的表达水平。检测结果发现，MC-LR暴露后白鲢肝脏miR-16、miR-181a-3p、miR-223和miR-451的表达水平升高。然而，在白鲢脾脏、肾脏和肠这些miRNAs的表达变化不同。这些结果表明，由于器官功能的差异，miRNAs的表达水平可能具有组织特异性。通过查阅相关文献结合本研究的实验结果发现，miR-16和miR-181a-3p可能协同参与了MC-LR诱导的肝脏炎症反应。同时，miR-223和miR-451可能成为MC-LR肝毒性生物标志物；miR-223可能通过调控细胞周期变化参与了MC-LR的毒性作用，而miR-451可能通过调控多种信号通路参与了MC-LR的毒性作用。综上，我们推测这4种miRNAs可能参与了MC-LR对多器官的毒性作用，尤其是肝毒性。
　　(3)miR-16在MC-LR致斑马鱼肝毒性中的表达及其可能的作用
　　通过测序结果和分析，我们发现miR-16并选择其作为进一步研究的目的miRNA。对miR-16进行生物信息学分析，比对人和斑马鱼miR-16的成熟序列及其前体序列，发现其种子序列基本一致。此外，还比对众多物种miR-16的成熟序列，构建了系统进化树，发现miR-16在不同物种之间的保守性较强。研究了miR-16在MC-LR致斑马鱼肝毒性中的表达，结果表明miR-16可能参与调控MC-LR诱导的细胞周期、细胞凋亡以及炎症反应相关基因表达的改变，与MC-LR肝毒性相关，并可能在其中发挥调控作用。
　　(4)MC-LR致HepG2细胞毒性中miR-16的表达及其作用研究
　　通过利用人肝癌细胞HepG2细胞体外实验探究miR-16对MC-LR暴露诱导的HepG2肝细胞毒性、细胞凋亡和细胞周期改变的影响极其机制。首先探究了MC-LR暴露对HepG2细胞活力、细胞周期、细胞凋亡以及miR-16表达的影响，结果表明低剂量MC-LR可促进细胞活力，且低剂量MC-LR暴露(10μM)对HepG2细胞凋亡无影响， 但会促进HepG2细胞G1/S细胞周期进程。miR-16表达的检测结果表明，低剂量MC-LR暴露可抑制miR-16表达。因此，我们推测miR-16可能参与MC-LR诱导的细胞周期的改变。为了证实这一推测，本实验检测了miR-16过表达和表达抑制对MC-LR处理HepG2细胞活力、细胞周期、细胞凋亡及其相关基因和蛋白的影响。细胞活力检测结果表明，miR-16过表达抑制了MC-LR诱导的HepG2细胞活力，而miR-16抑制则促进了MC-LR引起的HepG2细胞活力。流式细胞仪检测的细胞周期结果表明，miR-16的过表达诱导了G0/G1期细胞的增加和S期细胞的减少。细胞凋亡检测结果表明，在MC-LR暴露后，miR-16的过表达或抑制作用不会改变HepG2细胞凋亡。通过qPCR检测细胞凋亡相关基因表达结果表明，miR-16可能不是通过调控Bcl-2参与细胞周期和细胞凋亡的过程变化，但可能通过调控Bax参与细胞周期进展的过程。此外，miR-16表达抑制下调了MC-LR处理的HepG2细胞中p53的表达，而miR-16的过表达上调了p53的表达。而且，P53蛋白质水平与mRNA表达水平一致，说明了miR-16可能通过调控p53参与了由MC-LR暴露诱导的细胞周期变化。有研究揭示miR-16家族通过同时沉默多个细胞周期基因而不是单个靶标来触发G0/G1细胞的积累。
　　因此，结合本研究的结果有理由相信miR-16可能通过调节多个细胞周期基因(包括CDK6)参与细胞周期进程的改变。在本研究中，当miR-16过表达或抑制时，MC-LR处理的HepG2细胞PTEN和c-myc的表达也受到干扰。但是，miR-16与c-myc和PTEN之间的关系仍然不清楚，需要在以后的工作中进行研究。综合以上的结果证实，miR-16可能通过改变p53、CDK6、PTEN和c-myc的表达参与MC-LR致HepG2细胞周期调控。
　　本研究的主要结论：
　　(1)miRNAs可能在MC-LR肝毒性中发挥重要的调控作用。筛选出4种miRNAs(miR-16、miR-181a-3p、miR-223、miR-451)，与MC-LR肝毒性相关。
　　(2)MC-LR暴露后，4个miRNAs(miR-16、miR-181a-3p、miR-223、miR-451)在白鲢肝脏、脾脏、肾脏和肠中表达发生了改变，其表达具有组织特异性。
　　(3)miR-16在不同物种之间有较强的保守性；miR-16可能与MC-LR诱导的斑马鱼肝脏细胞周期、细胞凋亡以及炎症反应的改变相关。
　　(4)低剂量MC-LR暴露可促进HepG2细胞活力，并抑制细胞凋亡相关基因的表达。MC-LR暴露还诱导miR-16表达的下调。进一步的研究表明，过表达miR-16可通过改变P53、CDK6、PTEN和c-Myc的表达而抑制MC-LR暴露引起的HepG2细胞细胞周期的改变。这些结果提示，miR-16可能对MC-LR诱导的细胞周期改变有调控作用。