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类风湿关节炎（rheumatoid arthritis,RA）是一种自身免疫性疾病,其临床症状表现呈昼夜节律性,如关节肿胀、僵硬和疼痛在清晨加重,下午相对缓解。尽管目前有关RA的治疗方案有很多,但临床疗效仍不能满足临床需求。因此从新的角度探索RA治疗策略成为当前国际风湿学界的共识。雷公藤（tripterygium wilfordii Hook F,Tw HF）是我国治疗RA的最有效中药之一,但其常见的生殖毒性、肝毒性等限制了其治疗应用。进一步提高疗效、减轻生殖毒性等不良反应成为其临床推广应用的关键问题。现代时间生物医学研究提示,识别药物药效和毒性随昼夜时间变化的规律,将有助于提高其临床疗效和减少不良反应。目的:本研究在观察雷公藤多苷（tripterygium glycosides,TG）对胶原诱导关节炎（collagen-induced arthritis,CIA）雄性大鼠生殖毒性是否存在剂量依赖性的基础上,进一步探讨不同时间点给予TG对CIA雄性大鼠生殖损伤的昼夜节律性,并探索其与生物钟基因的关系,为TG时间治疗RA提供实验依据。方法:1.实验分组及处理1.1不同剂量雷公藤多苷对CIA雄性大鼠生殖毒性的影响选用80只健康雄性Wistar大鼠,在光暗交替（12/12,明期6:00～18:00,暗期18:00～6:00）的条件下饲养,适应环境1周。采用大鼠足爪、尾跟皮下多点注射Ⅱ型胶原乳剂建立CIA模型,选取造模成功的32只大鼠,根据随机数字表法随机分为CIA模型组、TG临床等效剂量组(9 mg·kg-1·d-1)、TG 3倍剂量组(27 mg·kg-1·d-1)、TG 6倍剂量组(54 mg·kg-1·d-1),每组8只,另设同期健康对照组大鼠8只。健康对照组与CIA模型对照组分别给予等量的生理盐水,连续给药8周。1.2雷公藤多苷致CIA雄性大鼠生殖毒性的昼夜节律性研究选用60只健康雄性Wistar大鼠,采用上述方法建立CIA模型,取造模成功的35只大鼠,根据随机数字表法随机分为CIA模型组和实验组（TG不同时间给药）,每组5只。实验组分别于授时时间（zeitgeber time,ZT,以ZT0为光照开始）2h、ZT6h、ZT10h、ZT14h、ZT18h、ZT22h给予TG 54 mg·kg-1·d-1,另设同期健康对照组大鼠5只。健康对照组与CIA模型对照组分别给予等量的生理盐水,连续给药2周。2.每周测体重及采用足趾容积测量仪检测双足趾肿胀度的变化;ELISA法检测大鼠血清肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）、白介素-6（interleukin-6,IL-6）分泌水平;放射免疫法检测大鼠血清中睾酮（testosterone,T）、促卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone,FSH）、促黄体生成激素（luteinizing hormone,LH）分泌水平;计算睾丸脏器指数;记录畸形的精子数并计算精子畸形率;光镜下观察踝关节和睾丸组织形态学变化;免疫组织化学法检测雄激素受体（AR）、CYP17A1、CLOCK和BMAL1表达水平;实时定量PCR检测生物钟基因CLOCK、BMAL1在大鼠睾丸的表达。3.实验数据采用SPSS 22.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差（x±s）表示。组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA）;两两比较且方差齐时采用LSD法检验,方差不齐时采用Dunnett’s T3法检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。结果:1.不同剂量雷公藤多苷对CIA雄性大鼠生殖毒性的影响1.1各组大鼠足趾肿胀度与体重变化随着造模时间的延长,各组大鼠的体重逐渐增加,足趾肿胀度先增加后下降。在造模后第3周,与健康组比较,CIA模型组大鼠的体重增重率降低（P＜0.01）、足趾肿胀率显著增高（P＜0.001）;与CIA模型组比较,给药后大鼠体重增重率增加,足趾肿胀率下降,在给药第4周及第8周时,TG中、高剂量给药组的足趾肿胀率明显降低（P＜0.05）,呈剂量依赖性。1.2各组大鼠睾丸指数与精子畸形率的变化给药8周后,与健康组比较,CIA模型组大鼠睾丸外观形态无明显差异,睾丸颗粒饱满、充盈;而TG治疗组大鼠睾丸有萎缩趋势,精子数量减少,表现为精子头尾分离、折叠、无钩、无定型等现象显著增多;并且随TG给药剂量的增加,睾丸指数明显下降,附睾精子畸形率显著增高,呈剂量依赖性。1.3各组大鼠血清IL-6、TNF-α含量的变化给药8周后,与健康对照组比较,CIA模型组大鼠血清IL-6、TNF-α水平明显升高（P＜0.01）;与CIA模型组相比,TG治疗组大鼠血清IL-6、TNF-α水平显著降低（P＜0.05）,并且呈剂量依赖性。1.4各组大鼠血清T、LH、FSH水平的变化给药8周后,与健康对照组比较,模型组大鼠血清T显著降低（P＜0.05）;与CIA模型组相比,各剂量TG可使血清T水平明显下降（P＜0.05）,并随给药剂量的增加而下降;而TG各剂量组大鼠的FSH和LH水平均未表现显著差异。1.5各组大鼠踝关节及睾丸组织病理形态学变化与健康对照组比较,CIA模型组大鼠踝关节可见滑膜组织明显增厚,可见乳突状突起,大量炎细胞浸润;睾丸组织中生精小管结构稍有不规则、异常结构稍增多,有些腔内可见脱落细胞块;与CIA模型组比较,给药8周后,TG各剂量组既可不同程度改善大鼠踝关节炎症程度,也可致大鼠睾丸不同程度组织病理学损伤,出现生精小管空泡化,基膜缺损,各级生精细胞不同程度减少。1.6各组大鼠睾丸组织中AR、CYP17A1、CLOCK、BMAL1表达的变化免疫组织化学检测发现,AR在生精小管基膜中少量表达,CYP17A1在间质细胞中少量表达,而CLOCK及BMAL1在生精小管内普遍表达。随着TG给药剂量的增加,AR、CYP17A1、CLOCK及BMAL1表达逐渐减少。1.7各组大鼠睾丸组织中CLOCK及BMAL1 m RNA表达的变化与健康对照组比较,CIA模型组大鼠睾丸CLOCK、BMAL1 m RNA表达均明显下降（P＜0.001）;给药8周后,TG各剂量组大鼠睾丸CLOCK、BMAL1 m RNA表达较模型对照组均显著升高（P＜0.05）,并随给药剂量增加先升高后下降,考虑TG高剂量致睾丸毒性可能与CLOCK、BMAL1基因的表达相关。2.雷公藤多苷致CIA雄性大鼠生殖毒性的昼夜节律性研究2.1 TG对CIA大鼠足趾肿胀度的昼夜影响给药2周后,TG不同时间给药组的足趾肿胀率明显低于CIA模型组（P＜0.05）;与白天给药相比,夜晚给药组显示出更强的抑制足爪肿胀率的趋势,但无统计学差异。2.2 TG对CIA大鼠睾丸指数与精子畸形率的昼夜影响给药2周后,与CIA模型组相比,TG不同时间给药组大鼠睾丸外观形态无明显差异,睾丸指数变化不显著,但附睾精子畸形率显著提高,且显示出明显的时间依赖性:ZT10给药组精子畸形率最高,ZT22给药组畸形率最低。2.3 TG对CIA大鼠血清IL-6、TNF-α水平的昼夜影响与健康对照组相比,CIA模型组大鼠血清IL-6、TNF-α水平明显升高（P＜0.001）;与CIA模型组相比,TG可减低血清IL-6、TNF-α水平（P＜0.05）,其中在ZT14给药组血清IL-6、TNF-α水平显著降低,ZT22给药组水平最高。2.4 TG对CIA大鼠血清T、LH、FSH水平的昼夜影响给药2周后,与CIA模型组相比,TG不同时间给药组大鼠血清T、LH、FSH水平明显降低（P＜0.05）。其中血清T含量水平在ZT22给药组最高,于ZT10给药组最低;而LH、FSH在不同时间给药之间差异不显著。2.5 TG对CIA大鼠睾丸组织病理形态学的昼夜影响大鼠睾丸染色结果显示,TG不同时间给药组大鼠睾丸中生精小管空泡化,各级精细胞减少;其中ZT10给药组大鼠生精小管基膜明显缺损,各级生精细胞排列紊乱,精细胞数量减少;而ZT22给药组大鼠生精小管基膜稍有缺损,精细胞数量减少,但睾丸结构较为清晰。2.6 TG对CIA大鼠睾丸组织中AR、CYP17A1、CLOCK、BMAL1表达的昼夜影响免疫组织化学检测发现,TG不同时间给药组中有少量AR、CYP17A1表达,但无显著差异;各组间CLOCK及BMAL1的表达明显增加,其中与ZT10给药组比较,ZT22给药组CLOCK及BMAL1表达显著减少。2.7 TG对CIA大鼠睾丸组织中CLOCK及BMAL1 m RNA表达的昼夜影响给药2周后,TG可显著上调CIA大鼠睾丸组织CLOCK和BMAL1m RNA表达水平（P＜0.01）;TG各组睾丸CLOCK和BMAL1 m RNA表达水平随给药时间变化,在ZT14给药组最高,在ZT22给药组最低;其中与ZT14给药组比较,ZT22给药组CLOCK m RNA表达水平显著降低（P＜0.05）。结论:1.TG可改善CIA大鼠足趾肿胀率和降低血清中细胞因子IL-6和TNF-α的水平,且呈昼夜节律性,降低细胞因子的作用于ZT14时给药疗效显著,而于ZT22时给药疗效较差。2.TG对雄性CIA大鼠有明显的生殖毒性,主要表现为睾丸脏器指数下降,附睾精子数目减少,畸形精子率升高及生精小管空泡化,基膜缺损,各级生精细胞不同程度减少。其毒性机制与降低T的分泌及AR、CYP17A1的表达有关。TG对雄性CIA大鼠的生殖毒性具有显著的昼夜变化,于ZT22时给药毒性最小,ZT10时给药毒性最大。3.TG于ZT22给药对CIA大鼠具有明显的减毒效应,为临床TG的时间治疗学提供了实验依据;其相关机制可能与调控CLOCK、BMAL1时钟基因表达,直接/间接影响炎性细胞因子及性激素分泌等有关。