论文部分内容阅读
目的:肥胖已成为严峻的公共卫生问题,与肥胖相关的慢性疾病的发病率也明显升高。因此,寻找新的、有效的干预措施和治疗靶点显得非常迫切。本文通过条件敲除小鼠模型和Cre重组酶诱导的、腺相关病毒介导的基因操纵方法,研究了下丘脑弓状核AgRP（Agouti-relatedpeptide）神经元中Stim1基因在营养性肥胖,及其并发症中所起的作用,以及它的作用机制,以期为肥胖的干预提供新的靶点。方法:首先,通过免疫印迹法和免疫荧光法分析Stim1在小鼠下丘脑中的表达。然后,利用活体钙成像分析高脂食物饲养3天,第三脑室a CSF（Artificial cerebrospinal fluid）或BTP2给药后,小鼠下丘脑弓状核神经元中钙离子浓度的改变。连续14天,在成年雄性小鼠第三脑室给予a CSF或BTP2,同时给予高脂食物饲养。比较两组小鼠的进食量、体重、体脂重、瘦体重、附睾白色脂肪、葡萄糖耐量、肝脏脂滴、血浆总胆固醇、小鼠肩胛骨间皮肤表面温度、小鼠耗氧量和能量消耗等。将AgRP-Cre小鼠与Stim1lox P/lox P小鼠交配,得到在AgRP神经元中特异性敲除Stim1的小鼠。利用活体钙成像技术检测Stim1敲除对AgRP神经元钙离子浓度的影响。给予敲除组小鼠（ASKO）与对照组小鼠（Stim1lox P/lox P）高脂食物饲养,比较两组小鼠在体重、进食量、产热及糖脂代谢等方面差异。构建AAV-EF1a-DIO-Stim1 D76A（AAV,Adeno-associated virus）质粒。通过细胞钙成像检测其对Ca2+内流的影响。将Stim1 D76A-AAV和Ctrl-AAV分别注射至AgRP-Cre（Cre,Cyclization recombination enzyme）雄性小鼠的弓状核中,得到在AgRP神经元中特异性表达Stim1 D76A的小鼠。给予Stim1活化组小鼠（Stim1D76A-AAV）与对照组小鼠（Ctrl-AAV）普通食物饲养;测量两组小鼠的体重、进食量、产热和糖脂代谢等指标。Neuro2a细胞给予SOCE抑制剂、敲低Stim1或过表达Stim1 D76A等处理,利用嘌呤霉素标记法,分析新合成的蛋白量的差异;利用定量PCR（q RT-PCR,Quantitative real-time PCR）技术检测经过同样处理的Neuro2a细胞的核糖体m RNA和r RNA的表达水平。利用q RT-PCR和免疫印迹法检查经过同样处理的Neuro2a细胞中Oas3和RNase L的m RNA及蛋白的水平。将Oas3-AAV和Ctrl-AAV腺相关病毒分别注射到AgRP-Cre小鼠的弓状核中。比较两组小鼠的体重、进食量,以及附睾脂肪组织和肝脏的组织学的差异。最后,将ns2-AAV和Ctrl-AAV腺相关病毒分别注射到ASKO和Stim1lox P/lox P小鼠的弓状核。观察小鼠在体重、进食量、体成分,以及附睾脂肪组织和肝脏的组织学等方面发生的变化。结果:Stim1蛋白在小鼠下丘脑弓状核约90%的神经元中表达。利用第三脑室给药给予BTP2阻断SOCE,小鼠Arc神经元胞内钙离子信号强度相较对照组明显降低。每天在第三脑室注射BTP2的小鼠,其在高脂食物（HFD,High-fat diet）饲养条件下体重增加比对照组少约1.5 g（P＜0.05）,体脂重的增加也比对照组少约1 g（P=0.01）,糖脂代谢得到改善,对高脂食物的摄入也相对较少,产热增加。在AgRP神经元中敲除Stim1后,其钙离子信号强度在普通食物、HFD 3d或HFD7d饲养条件中的禁食刺激下低于对照组。在HFD饲养的对照及AgRP神经元特异性敲除Stim1的小鼠中,敲除组与其对照组相比,敲除组小鼠的体重明显偏低10 g左右（P＜0.05）,糖脂代谢改善,能量摄入减少且能量消耗增加。通过表达Stim1 D76A活化SOCE的Neuro2a细胞,胞外钙离子内流的能力明显增强。在普通食物饲养的AgRP-Cre的小鼠中,选择性地在AgRP神经元中表达Stim1D76A的小鼠与对照组相比,其体重增加约4~5 g（P＜0.05）,糖脂代谢平衡紊乱,食物摄入增加约0.7g（P＜0.05）,能量消耗明显减少。Neuro2a细胞给予SOCE抑制剂或将Stim1敲低后,细胞新合成蛋白减少30-40%,核糖体m RNA和r RNA水平下降,Oas3的m RNA和蛋白水平相较对照组升高约0.5倍（P＜0.05）,RNase L的m RNA和蛋白水平无明显差异。当Neuro2a细胞表达Stim1 D76A后,细胞新合成的蛋白增加约50%（P＜0.05）;核糖体m RNA和r RNA表达水平增加（P＜0.05）;Oas3的m RNA和蛋白水平相较对照组降低约50%（P＜0.05）,RNase L的m RNA和蛋白水平无明显差异。在AgRP神经元中过表达Oas3,进行高脂食物饲养的小鼠,相比对照组小鼠,其体重减少约10 g（P＜0.05）、体脂重减少约6 g（P＜0.05）和平均每日进食量也减少（P＜0.05）。在ASKO小鼠的AgRP神经元中表达ns2,进行高脂食物饲养的小鼠,相比ASKO对照病毒注射组小鼠,其体重增加约6 g（P＜0.05）、体脂重增加约4 g（P＜0.05）和平均每日进食量也明显增加（P＜0.05）。结论:下丘脑弓状核AgRP神经元的Stim1在营养性肥胖的形成中起重要作用。其可通过Oas3-RNase L信号通路调控蛋白质的合成,进而影响AgRP神经元的功能,从而在营养性肥胖地形成中起作用。