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【目的】
本研究以Pristane为诱导剂实现小鼠SLE疾病模型的建立,探索Pristane诱导的SLE中B细胞的异常变化,研究TJ-M2010-5对体外异常活跃B细胞的抑制作用及其机理。
【方法】
1、体内实验:选取体重18-20g之间的雌性BALB/c小鼠,一次性腹腔注射Pristane(25μl/kg)建立小鼠SLE模型。WesternBlot检测建模后小鼠脾脏中MyD88在蛋白水平表达变化情况。实验小鼠分为两组:正常对照组(A组):腹腔注射与Pristane等剂量的生理盐水;模型组(B组):腹腔注射Pristane(25μl/kg)。收集建模后6个月的小鼠血清,检测Cr和BUN含量,收集小鼠晨尿检测PRO以反映肾功能变化,检测抗ANA抗体表达水平反映SLE活跃情况,检测IL-10、TNF-α和IL-6等细胞因子表达水平以反映全身炎症情况。收集建模后6个月小鼠脾脏组织,流式检测脾脏B细胞亚群变化。收集建模后6个月小鼠肾脏组织,H&E染色检测肾脏损伤程度和免疫细胞浸润情况,免疫荧光染色检测肾脏组织中总IgG免疫复合物浸润情况。
2、体外实验:提取6-8周雌性BALB/C小鼠脾脏细胞,磁珠分选的原代B细胞悬液,加入CD40L(40ng/ml)培养。原代B细胞予以不同浓度的MyD88抑制剂TJ-M2010-5(10、20μmol/L)处理3h后,再用R848(50ng/ml)刺激12h,流式细胞术检测B220+CD25+、B220+CD69+和B220+CD138+细胞比例;原代B细胞予以不同浓度的MyD88抑制剂TJ-M2010-5(10、20μmol/L)处理3h后,再用R848(500ng/ml)刺激48h,收集细胞培养上清,提取细胞蛋白和总RNA。RT-PCR检测MyD88、TLR7和IL-6转录情况;ELISA检测细胞培养上清IL-6、总IgG和抗ANA抗体表达水平;Westernblot检测细胞MyD88、TLR7、P38、ERK、JNK蛋白及P38、ERK、JNK磷酸化蛋白表达情况,检测细胞NF-κB蛋白入核情况;AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡,CFSE检测细胞增殖。
【结果】
1、体内实验:SLE小鼠疾病模型建立:Pristane刺激6个月后,小鼠脾脏组织MyD88在蛋白水平均高表达,与A组小鼠比较有明显统计学差异(P<0.01)。B组小鼠血清Cr、BUN含量上升,晨尿PRO轻微上升(P<0.05)。血清ELISA检测抗ANA抗体、TNF-α、IL-10、和IL-6水平结果提示B组SLE疾病活跃程度及全身炎症水平较正常对照组升高(P<0.01);脾脏流式检测显示:B组小鼠脾脏B细胞中CD25+CD19+B220+、CD69+CD19+B220+、CD27+CD19+B220+和CD138hiCD3-B220lo细胞比例升高(P<0.05);B组肾脏H&E病理染色提示:肾小球毛细血管腔内有透明样血栓,肾间质大量炎症细胞浸润,肾小球基底膜增厚,肾小球轮廓不清,A组无明显上述病理变化。以上均提示Pristane可成功诱导小鼠SLE模型。
2、体外实验:R848刺激小鼠原代B细胞后,流式细胞术检测B220+CD25+、B220+CD69+和B220+CD138+细胞比例明显升高;而TJ-M2010-5预处理后可降低B220+CD25+、B220+CD69+和B220+CD138+细胞比例,并呈浓度梯度依赖性。实时荧光定量PCR结果提示R848刺激促进B细胞转录MyD88、TLR7和IL-6等,而TJ-M2010-5预处理可降低这些蛋白和因子的转录。ELISA检测细胞培养上清IL-6分泌情况,结果与上述一致。同时B细胞经R848刺激后大量分泌总IgG及抗ANA抗体,TJ-M2010-5预处理可降低这些抗体的分泌。TJ-M2010-5可抑制R848引起的B细胞MyD88、TLR7蛋白的高表达,减轻P38、ERK、JNK的磷酸化,同时,降低NF-κB入核能力。另外,R848可抑制B细胞的凋亡,并促进其增殖,TJ-M2010-5预处理则可促进异常活跃B细胞的凋亡并抑制其增殖。
【结论】
1、MyD88分子参与了Pristane诱导的小鼠SLE的病理生理过程;2、TJ-M2010-5能够抑制R848诱导的体外B细胞的活化、分化和增殖,并促进异常活跃B细胞凋亡;3、这种抑制效果主要源自于对TLR7/MyD88/NF-κB和TLR7/MyD88/MAPK信号通路的抑制,从而表现为减少自身抗体及炎性因子的分泌。
本研究以Pristane为诱导剂实现小鼠SLE疾病模型的建立,探索Pristane诱导的SLE中B细胞的异常变化,研究TJ-M2010-5对体外异常活跃B细胞的抑制作用及其机理。
【方法】
1、体内实验:选取体重18-20g之间的雌性BALB/c小鼠,一次性腹腔注射Pristane(25μl/kg)建立小鼠SLE模型。WesternBlot检测建模后小鼠脾脏中MyD88在蛋白水平表达变化情况。实验小鼠分为两组:正常对照组(A组):腹腔注射与Pristane等剂量的生理盐水;模型组(B组):腹腔注射Pristane(25μl/kg)。收集建模后6个月的小鼠血清,检测Cr和BUN含量,收集小鼠晨尿检测PRO以反映肾功能变化,检测抗ANA抗体表达水平反映SLE活跃情况,检测IL-10、TNF-α和IL-6等细胞因子表达水平以反映全身炎症情况。收集建模后6个月小鼠脾脏组织,流式检测脾脏B细胞亚群变化。收集建模后6个月小鼠肾脏组织,H&E染色检测肾脏损伤程度和免疫细胞浸润情况,免疫荧光染色检测肾脏组织中总IgG免疫复合物浸润情况。
2、体外实验:提取6-8周雌性BALB/C小鼠脾脏细胞,磁珠分选的原代B细胞悬液,加入CD40L(40ng/ml)培养。原代B细胞予以不同浓度的MyD88抑制剂TJ-M2010-5(10、20μmol/L)处理3h后,再用R848(50ng/ml)刺激12h,流式细胞术检测B220+CD25+、B220+CD69+和B220+CD138+细胞比例;原代B细胞予以不同浓度的MyD88抑制剂TJ-M2010-5(10、20μmol/L)处理3h后,再用R848(500ng/ml)刺激48h,收集细胞培养上清,提取细胞蛋白和总RNA。RT-PCR检测MyD88、TLR7和IL-6转录情况;ELISA检测细胞培养上清IL-6、总IgG和抗ANA抗体表达水平;Westernblot检测细胞MyD88、TLR7、P38、ERK、JNK蛋白及P38、ERK、JNK磷酸化蛋白表达情况,检测细胞NF-κB蛋白入核情况;AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡,CFSE检测细胞增殖。
【结果】
1、体内实验:SLE小鼠疾病模型建立:Pristane刺激6个月后,小鼠脾脏组织MyD88在蛋白水平均高表达,与A组小鼠比较有明显统计学差异(P<0.01)。B组小鼠血清Cr、BUN含量上升,晨尿PRO轻微上升(P<0.05)。血清ELISA检测抗ANA抗体、TNF-α、IL-10、和IL-6水平结果提示B组SLE疾病活跃程度及全身炎症水平较正常对照组升高(P<0.01);脾脏流式检测显示:B组小鼠脾脏B细胞中CD25+CD19+B220+、CD69+CD19+B220+、CD27+CD19+B220+和CD138hiCD3-B220lo细胞比例升高(P<0.05);B组肾脏H&E病理染色提示:肾小球毛细血管腔内有透明样血栓,肾间质大量炎症细胞浸润,肾小球基底膜增厚,肾小球轮廓不清,A组无明显上述病理变化。以上均提示Pristane可成功诱导小鼠SLE模型。
2、体外实验:R848刺激小鼠原代B细胞后,流式细胞术检测B220+CD25+、B220+CD69+和B220+CD138+细胞比例明显升高;而TJ-M2010-5预处理后可降低B220+CD25+、B220+CD69+和B220+CD138+细胞比例,并呈浓度梯度依赖性。实时荧光定量PCR结果提示R848刺激促进B细胞转录MyD88、TLR7和IL-6等,而TJ-M2010-5预处理可降低这些蛋白和因子的转录。ELISA检测细胞培养上清IL-6分泌情况,结果与上述一致。同时B细胞经R848刺激后大量分泌总IgG及抗ANA抗体,TJ-M2010-5预处理可降低这些抗体的分泌。TJ-M2010-5可抑制R848引起的B细胞MyD88、TLR7蛋白的高表达,减轻P38、ERK、JNK的磷酸化,同时,降低NF-κB入核能力。另外,R848可抑制B细胞的凋亡,并促进其增殖,TJ-M2010-5预处理则可促进异常活跃B细胞的凋亡并抑制其增殖。
【结论】
1、MyD88分子参与了Pristane诱导的小鼠SLE的病理生理过程;2、TJ-M2010-5能够抑制R848诱导的体外B细胞的活化、分化和增殖,并促进异常活跃B细胞凋亡;3、这种抑制效果主要源自于对TLR7/MyD88/NF-κB和TLR7/MyD88/MAPK信号通路的抑制,从而表现为减少自身抗体及炎性因子的分泌。