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目的:骨质疏松症是由于多种原因导致的骨微结构破坏、骨密度减低、骨生物力学性能下降,从而引起疼痛、骨骼变形甚至骨折的全身性骨病。随着社会人口的老龄化,骨质疏松症的发病率和骨质疏松性骨折的患病率呈上升趋势,已经成为严重的危害社会公共健康问题。全身性骨质疏松同样会影响口颌系统健康,与牙周炎的发生发展密切相关,对于种植义齿修复的早期和预后也会产生不良影响。研究表明,骨质疏松症的主要病理生理机制之一是成骨细胞增殖、分化和矿化功能受损。因此,深入研究成骨细胞分化和矿化的调控机制对于了解骨质疏松症的发病机制和探索有效的治疗方法具有重要意义。泛素化是真核细胞内蛋白质功能调控的重要途径,其中E3泛素连接酶在维持成骨细胞正常生理功能方面发挥着重要作用。例如,E3连接酶Schnurri-3（Shn3）通过将WWP1结合到Runx2促进Runx2的降解,从而调节成骨功能;Smurf1抑制成骨细胞分化成熟,敲除Smurf1可促进成骨细胞分化和新骨形成。因此,E3连接酶可能成为骨质疏松症的一个新的治疗靶点。MKRN1作为E3泛素连接酶识别多种底物靶蛋白,使其泛素化并通过蛋白酶体降解,从而调控多种生理功能。PPARγ是调节细胞分化的重要因子,主要表达于脂肪组织及免疫系统,参与多种分子机制的调控,与脂肪细胞分化、机体免疫、肥胖及胰岛素抵抗关系密切。近年来有研究发现PPARγ在骨代谢领域也发挥作用。有报道指出PPARγ的亚型PPARγ2可通过抑制cbfa1的表达抑制间充质干细胞向成骨细胞分化,并且可通过上调IL-4的活性抑制破骨细胞的分化。PPARγ还可以与转化生长因子TGF-β/Smad3相互作用,抑制成骨细胞的分化。在鼠上颌骨扩张的动物模型显示使用PPARγ激动剂可以减少上颌中缝扩张的新骨形成,而PPARγ敲除的小鼠新骨形成增加、破骨细胞数量减少、促进破骨细胞生成的基因表达降低。PPARγ生物学功能受到多种E3泛素连接酶的调控。2014年有研究发现PPARγ受MKRN1调控,K184和K185是PPARγ被MKRN1泛素化修饰的两个赖氨酸位点。敲低MKRN1的表达后,具有多向分化潜能的细胞中PPARγ表达增高,促进细胞分化为脂肪细胞,而向成骨细胞分化受到抑制,进一步证明了MKRN1蛋白对PPARγ负调控的生理功能,表明MKRN1可能是PPARγ相关疾病的潜在治疗靶点。目前关于MKRN1对成骨细胞分化功能的影响未见报道,本研究将深入探索E3泛素连接酶MKRN1在MC3T3-E1细胞成骨分化过程中的作用,为骨质疏松类疾病的治疗提供新的方案和依据。研究方法:1.MKRN1对MC3T3-E1细胞成骨分化的影响RT-qPCR和Western Blot检测MC3T3-E1细胞成骨分化过程中MKRN1 mRNA和蛋白表达量与时间的相关性。构建腺病毒载体感染MC3T3-E1细胞过表达或敲低MKRN1,成骨分化诱导后检测ALP活性;RT-qPCR、Western Blot检测Runx2、Co L1A1、OCN的表达水平;茜素红染色检测矿化结节形成情况。2.MKRN1和PPARγ共同作用对MC3T3-E1细胞成骨分化的影响腺病毒载体感染MC3T3-E1细胞,敲低MKRN1与PPARγ的表达后诱导细胞成骨分化,检测ALP活性;RT-qPCR、Western Blot检测Runx2、Co L1A1、OCN的表达水平;茜素红染色检测矿化结节形成情况。3.MKRN1对MC3T3-E1细胞中PPARγ表达的影响Western Blot检测过表达或敲低MKRN1对细胞内PPARγ蛋白表达水平的影响;Co-IP检测MC3T3-E1细胞内源性MKRN1和PPARγ结合情况;Co-IP检测过表达MKRN1后细胞内PPARγ蛋白的泛素化水平;Western Blot检测添加MG132后,过表达MKRN1对于细胞内PPARγ表达情况的影响。结果:1.MC3T3-E1细胞成骨分化过程中,MKRN1 mRNA和蛋白的表达水平随着分化时间延长而升高;腺病毒载体能够稳定转染MC3T3-E1细胞,实现MKRN1过表达或敲低;敲低MKRN1表达后,与空白对照组和阴性转染组相比较,ALP活性,Runx2、COL1A1和OCN mRNA和蛋白的表达均显著降低,矿化结节形成减少（P＜0.05）;MKRN1过表达的MC3T3-E1细胞ALP活性,Runx2、COL1A1和OCN mRNA及蛋白表达量及矿化结节形成均高于空白对照组和空载转染组（P＜0.05）。2.腺病毒载体能够稳定转染MC3T3-E1细胞,干扰PPARγ的表达;干扰MC3T3-E1细胞中PPARγ的表达,可以逆转MKRN1敲低后对细胞成骨分化和矿化功能的抑制作用。3.MC3T3-E1细胞成骨分化显著降低PPARγ蛋白表达水平;敲低MKRN1表达后PPARγ蛋白表达水平升高,而过表达MKRN1降低了PPARγ蛋白表达（P＜0.01）;Co-IP证实了内源性MKRN1和PPARγ在细胞中具有相互作用;MKRN1过表达提高了PPARγ的泛素化水平;加入MG132逆转了过表达MKRN1对PPARγ表达的抑制作用。结论:1.E3泛素连接酶MKRN1促进MC3T3-E1细胞的成骨向分化。2.在MC3T3-E1细胞成骨分化过程中,MKRN1通过增强PPARγ泛素化降解发挥功能。