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[目 的]甲状腺未分化癌（anaplastic thyroid carcinoma,ATC）是一种罕见且恶性度极高的肿瘤。紫杉醇（paclitaxel,PTX）是ATC全身治疗最常用的化疗药物,但耐药却很常见,关于耐药后解决方案的研究很少,使其成为一个临床治疗难题。将PTX与靶向ATC独特分子特征的药物有效结合起来是ATC治疗的一个发展方向。因此,开展各种临床前基础研究和临床试验来探索PTX与分子靶向药物联用的最佳治疗组合,对于改善患者的预后是非常有必要的。近年来通过CRISPR/Cas9组学文库同时靶向敲除多个基因进行功能缺失筛选开发出多个新治疗组合。因此,本课题从临床问题出发,拟通过在ATC细胞中用CRISPR/Cas9激酶组学文库进行阴性筛选,寻找能够与PTX有协同致死作用的可靶向激酶分子,研究相应联合治疗策略的体内外效果并探索增敏机制,旨在为PTX耐药或不能耐受其毒副作用的ATC患者提供新的治疗方案和理论依据。[方法]1、ATC细胞感染CRISPR激酶组学文库进行阴性筛选在人ATC细胞8305C和CAL62中感染CRISPR激酶组学文库,一组加入PTX,另一组不加药物,收取第0、7、14和21天细胞DNA,探索合适的PCR条件,扩增后将其产物高通量测序,经生物信息学分析获得潜在增敏靶点。同时通过药物浓度递增法构建两株细胞的PTX耐药株。2、验证PTX的协同致死激酶靶点首先,在8305C和CAL62细胞中用多个激酶抑制剂验证测序结果,确定进一步研究的激酶。通过CCK8实验验证DMSO、PTX、激酶抑制剂或两药联合对ATC细胞活力的影响。然后,在构建成功的8305C耐药株和CAL62耐药株中,一方面给予上述不同药物处理,另一方面用CRISPR/Cas9系统敲除激酶基因并加入PTX,通过CCK8实验和克隆形成实验比较各组细胞活力和克隆形成能力的变化。接下来,用Calcusyn软件计算两种药物的联合指数。为了探索是否可以扩大联合用药适应症,在人乳腺癌细胞MDA-MB-231和肺腺癌细胞A549中给予以上药物,通过CCK8实验检测各组细胞活力。3、探索抑制激酶联合PTX协同作用的机制将8305C耐药株经DMSO、PTX、激酶抑制剂或两药联合的不同处理后进行转录组测序,经生物信息学分析获得联合加药组的特有差异基因及富集的功能和信号通路。然后在8305C耐药株和CAL62耐药株中给予上述不同药物处理或敲除激酶基因后加入PTX,通过流式检测细胞周期与凋亡、EdU实验、WB实验和CCK8实验验证测序结果,并寻找协同作用的下游靶分子。4、探索抑制激酶联合PTX对裸鼠移植瘤生长的影响裸鼠皮下接种CAL62耐药株构建移植瘤模型,给予DMSO、PTX、激酶抑制剂或两药联合的不同处理。此外,另一批裸鼠皮下接种感染空载或激酶敲除序列的CAL62耐药株,再各分为两组,分别给予溶剂对照或PTX。两部分实验均比较不同处理对肿瘤体积和瘤重的影响。[结 果]1、ATC细胞感染CRISPR激酶组学文库进行阴性筛选ATC细胞8305C和CAL62感染CRISPR激酶组学文库,加药组给予IC20浓度的PTX,每个细胞共收取7个DNA样品,PCR的退火温度设置在61℃,循环数为22个,所有样品经琼脂糖凝胶电泳确认特异性良好。测序分析获得加PTX组较对照组缺失的sgRNAs对应的基因。2、抑制ROCK2增强细胞对PTX的敏感性我们筛选出6个基因,在8305C和CAL62细胞中用对应的激酶抑制剂验证测序结果显示,联合PTX达到同等抑制效果时ROCK2抑制剂Belumosudil的用药浓度最低。ROCK2的sgRNAs在两细胞中均呈加药组下降的趋势。GEO数据库分析显示,ATC组织中ROCK2的表达水平高于正常甲状腺组织。在8305C和CAL62细胞,Belumosudil联合PTX较单药组显著抑制细胞活力。在8305C耐药株和CAL62耐药株,同时给予Belumosudil和PTX或敲除ROCK2后加入PTX,与单药组或未敲除ROCK2组相比,显著抑制细胞活力和克隆形成能力。Belumosudil与PTX有协同作用,两药在多个不同浓度组合下联合指数＜1。此外,两药联合还可协同抑制MDA-MB-231和A549细胞的活力。3、抑制ROCK2联合PTX促进DNA损伤、G2/M期阻滞和凋亡,阻碍DNA合成8305C耐药株经不同药物处理的转录组测序发现,Belumosudil联合PTX组特有差异基因的GO富集分析主要参与核分裂、染色体分离和DNA复制,KEGG分析显示细胞周期和p53信号通路明显富集。在耐药株中同时给予Belumosudil和PTX或敲除ROCK2后加入PTX,与单药或未敲除ROCK2相比,G2/M期阻滞明显增强,周期相关蛋白CDK1、CDK2和cyclinB1的表达下降,DNA合成能力下降,DNA损伤标志物γ-H2AX表达升高。此外,Belumosudil联合PTX促进耐药株细胞凋亡,凋亡相关蛋白BAX和PARP裂解体表达升高,抗凋亡蛋白BCL-2表达下降。4、AURKB是Belumosudil/PTX协同作用的下游靶分子之一8305C耐药株测序结果显示联合加药组AURKB的表达下降。WB实验证实,在8305C耐药株,抑制ROCK2再联合PTX下调AURKB并激活p53的表达。加入AURKB抑制剂Barasertib可部分回复Belumosudil和PTX对细胞活力的抑制。5、抑制ROCK2联合PTX在体内有协同抗肿瘤作用利用CAL62耐药株在裸鼠体内进行ROCK2抑制剂Belumosudil和PTX的联合用药实验,发现二者联用后,较对照或PTX单药组均显著抑制肿瘤生长。与Belumosudil单药组相比有抑制肿瘤生长的趋势,但无统计学差异。此外,接种ROCK2敲除的CAL62耐药株的裸鼠给予PTX处理后,肿瘤生长较未敲除组减慢。提示抑制ROCK2可提高PTX的体内效果。[结 论]1、CRISPR文库筛选协同致死靶点是探索新药物组合的高效工具。2、ROCK2是ATC中PTX的协同致死靶点,ROCK2抑制剂Belumosudil或基因敲除ROCK2可增强ATC细胞对PTX的治疗敏感性。3、抑制ROCK2联合PTX促进细胞G2/M期阻滞和凋亡,促进细胞DNA损伤并抑制DNA合成。4、AURKB是Belumosudil/PTX协同作用的下游靶分子之一。5、抑制ROCK2在体内可增强ATC对PTX的治疗敏感性。