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第一部分,持续惊厥后海马突触前囊泡循环的变化 目的:观察惊厥发作后,幼年与成年鼠海马突触前囊泡释放的动态改变及年龄差异,研究惊厥发作对突触传递效能的影响。 方法:选用幼年和成年Wistar鼠,经腹腔注射氯化锂-匹罗卡品诱发。惊厥持续状态(status convulsion,SC),分别于1h SC发作后3h、1天、3天、7天4个时点处死。断头取脑。制作离体海马脑片,FM1-43标记功能性突触小泡,采用激光共聚焦显微镜观察,对海马CA1区FM1-43荧光强度进行半定量分析。 结果:①SC后3h,幼年鼠海马CA1区FM1-43荧光强度明显下降,达到最低谷101±8,明显低于惊厥前的136±10(P<0.01),SC后1d开始上升,SC后7d仍显著低于发作前水平(P<0.01)。②与幼年鼠相似,SC后成年鼠海马CA1区FM1-43荧光强度表达也呈下降的趋势。与发作前相比,SC后3h海马FM1-43荧光强度的下降即呈显著性差异(p<0.01),之后呈逐渐上升趋势,但至SC后7d始终明显低于发作前水平(P<0.01)。③与成年鼠相比,惊厥发作前,幼年鼠海马CA1区FM1-43荧光强度表达明显低于成年鼠(P<0.01)。惊厥后这一年龄差异性仍然存在,且至少持续至惊厥后7d(P<0.01)。 结论:①惊厥发作抑制了海马CA1区突触前功能性囊泡的释放,通过突触前机制诱导沉默突触的形成。②惊厥前后,幼年鼠海马CA1区突触囊泡的释放始终较成年鼠为低。幼年鼠脑内可能存在更多的沉默突触。 第二部分,持续惊厥后海马AMPA受体亚单位的表达 目的:观察惊厥发作后,AMPA受体4个亚单位表达的动态改变及年龄差异,分析AMPA受体在沉默突触转化、惊厥发生发展的作用。 方法:选用幼年和成年Wistar鼠,经腹腔注射氯化锂-匹罗卡品诱发SC,分别于1h SC发作后3h、1天、3天、7天4个时点处死。免疫双重荧光染色观察GluR1~GluR44个亚单位与突触素(SNP)的共定位与分布;蛋白质印迹(Western Blot)对GluR1~GluR44个亚基进行半定量分析。 结果:①SC后3h,成年鼠海马AMPA受体4个亚基的表达均明显低于惊厥前(P<0.01),至少维持至惊厥后1d,继之均逐渐升高。其中,GluR4的表达于SC后3天接近正常(P>0.05);GluR1和GluR3的表达于SC后7天接近正常(P>0.05);而GluR2的表达始终低于正常水平(P<0.01)。②对于幼年组,惊厥发作也抑制各AMPA受体亚基的表达。SC后3h,GluR1,3,4的表达明显低于惊厥前(P<0.01),而GluR2的表达至SC后3d才有显著降低。所有亚基的低水平表达至少维持至惊厥后7d。③惊厥发作前,幼年鼠海马AMPA受体各亚基的表达均明显低于成年鼠(P<0.01),这一年龄差异至少维持至惊厥发作后7d(P<0.05)。④惊厥发作前,成年鼠AMPA受体的亚基表达以GluR2为主,惊厥后7d以GluR2,3的表达为主。正常幼年鼠海马以GluR3,4为主,而以GluR2表达最低。惊厥快速启动了亚基构成的改变,但SC后7d,AMPA受体亚基组成与惊厥前基本一致。 结论:①持续1h的惊厥发作即可抑制幼年及成年鼠海马各AMPA受体亚基的表达,并改变了AMPA受体亚基的构成。②惊厥前后,幼年鼠海马AMPA受体的表达始终低于成年鼠。③惊厥发作可以通过突触后机制诱导沉默突触的产生。 第三部分,持续惊厥后海马AMPA受体介导微兴奋性突触后电流的改变 目的:AMPA受体介导mEPSCs频率与幅度的动态改变及年龄差异,从突触前及突触后作用位点探讨海马突触的可塑性。 方法:选用幼年和成年Wistar鼠,经腹腔注射氯化锂-匹罗卡品诱发SC,分别于1h SC发作后3h、1天、3天、7天4个时点处死。制作离体海马脑片,可视法膜片钳全细胞模式记录海马CA1区AMPA受体介导的mEPSCs。 结果:①SC后3h,幼年鼠海马CA1区AMPA受体介导的mEPSCs频率明显下降(P<0.01),SC后1d达到最低谷1.06±0.38 Hz,明显低于惊厥前的1.72±0.43(P<0.01),SC后3d开始缓慢上升,SC后7d达到1.60±0.42,但仍显著低于发作前水平(P<0.01)。成年鼠与幼年鼠mEPSCs频率的变化趋势相似。②SC后3h,幼年鼠海马CA1区AMPA受体介导的mEPSCs幅度明显下降,SC1d开始逐渐上升,SC后7d仍显著低于发作前水平(P<0.01)。成年鼠与幼年鼠mEPSCs幅度的变化趋势相似。③惊厥前后,幼年鼠海马CA1区mEPSCs频率始终低于成年鼠。但是SC后1d,幼年鼠AMPA受体介导的EPSCs幅度即较成年鼠高,并至少持续至惊厥后7d。 结论:①未成熟脑内存在更多的沉默突触。而且这些沉默突触既有突触前沉默,也有突触后沉默。②惊厥后,幼年鼠可能主要是通过突触前机制,成年鼠主要通过突触后机制形成沉默突触。