牛病毒性腹泻(Bovine viral diarrhea,BVD)是牛的主要疾病之一,可引起牛的生产性能下降而给养牛业造成重大经济损失。牛病毒性腹泻病毒基因组编码11种蛋白,其中E2蛋白是病毒主要的保护性抗原,能诱导中和抗体的产生,保护动物不受同源毒株的攻击。本试验用经序列测定已知的牛病毒性腹泻病毒BA毒株,接种MDBK细胞,提取病毒基因组RNA。根据BA毒株基因组序列,利用Oligo6生物学软件设计可以扩增E2蛋白的一对引物,引入酶切位点并去掉E2蛋白的跨膜区及疏水区。通过RT-PCR扩增了长约1000bp的E2基因片段,克隆到pMD18-T载体上,酶切并测序鉴定。然后将目的片段进一步定向克隆到pET30a表达载体,转化BL21表达菌。取转化菌培养,并用IPTG诱导,获得了以包涵体形式表达的重组蛋白。将重组蛋白经变性、纯化、复性后,用Western blotting、间接ELISA检测表明纯化的重组蛋白具有良好的免疫原性,为牛病毒性腹泻病毒诊断试剂的研制奠定了基础。同时利用GenBank中已发表的BVDV基因组序列中5’端保守序列设计巢式引物。应用Oligo6软件设计了2对引物,一对为外部引物,预期扩增片段大小为294bp;一对为内部引物,预期扩增片段大小为154bp。经过Blast对比分析,这一对引物可以检测所有类型的BVDV、猪瘟病毒和边界病病毒。应用这两对引物,建立了BVDV的巢式RT-PCR检测方法。应用该方法检测了现地采集的牛血清、商品化的细胞培养用新生牛血清和成年牛血清、流产牛胎儿组织等样品,结合核苷酸序列分析表明该方法可以特异地检测BVDV和猪瘟病毒的RNA,该法灵敏、准确、快速,可用于BVDV等瘟病毒RNA的快速检测。通过对扩增片段的核苷酸序列分析与系统进化树分析,初步确定国内流行的BVDV主要为Ⅰ型,可分为4个不同的亚型,为国内BVDV的防治提供了技术支持。本试验建立了BVDV RT-PCR诊断方法,并证明该方法不仅可以准确快速诊断BVDV,而且可以诊断BVDV同属的猪瘟病毒。同时利用pET30a表达载体成功克隆了BVDV E2基因,获得了以包涵体形式表达的目的蛋白。对包涵体蛋白进行了变性纯化,复性后依然具有良好的免疫原性。本实验利用建立的RT-PCR诊断方法,对国内BVDV感染情况做了一些基础性调查研究,希望能引起对本病的重视。