膀胱癌(Bladder cancer，BCa)是最常见的泌尿系统恶性肿瘤之一。在过去的十年中，它的发病率逐年上升，发病年龄逐年下降。治疗上，BCa对放化疗的敏感性较低，极易复发。传统BCa疗法的患者5年生存率已多年未见明显提高。临床上需要新的膀胱癌治疗方法和策略。基因治疗是一种很有前景的癌症治疗策略，如近几年发展起来的嵌合抗原受体T细胞(Chimeric antigen receptor T cells，CAR-T)免疫治疗技术和CRISPR技术等。这些基因治疗技术的关键点有两个:治疗性的基因线路，以及将它们递送到靶部位的方法。当前的递送策略主要有两种:(1)将体内细胞分离后在体外进行基因线路的导入或基因编辑，再将它们回输体内，如CAR-T技术;(2)直接将治疗性基因线路递送至患者体内靶部位发挥作用，该策略需要递送载体完成体内的高效递送，如膀胱灌注治疗载体。为了实现不同的递送目标，许多核酸递送系统被开发出来。其中包括了脂质体载体和阳离子纳米载体。经过适当的化学改造，这些化学合成载体可以获得其它载体没有的基因递送优势，如获得更强的装载能力、生物靶向的能力，以及更好的生物相容性等。为了能将这些优势尽可能的发挥出来，我们通过构建多层元件的载体，完成分级递送，即通过多种递送系统，实现多重靶向的功能。
　　1.靶向人CD19抗原的CAR-T免疫疗法已被证明对B淋巴细胞白血病具有良好的治疗效果。传统的CAR递送系统存在诸多问题，例如较差的生物安全性，较低的装载量，以及较低的递送效率。采用阳离子纳米载体进行CAR递送，为CAR-T细胞的生产提供了一个新的可能。本研究中，我们首先构建了一个可表达GFP的抗人CD19CAR慢病毒核心质粒，作为递送装载对象;随后，通过点击反应合成了一个基于阳离子聚合物PEI的双亲性三段式聚合物材料mPEG-bPEI-PEBP，作为CAR质粒和包装质粒的递送载体，以研究CAR的递送和相关的生物学功能。共聚物的PEBP和mPEG部分提供疏水和亲水的界面，使共聚物在水溶液中自组装为胶束，将DNA质粒包裹在其中，形成mPEG-bPEI-PEBP-DNA质粒纳米复合物。将其转染Jurkat细胞或正常T细胞，以表达anti-CD19CAR功能蛋白。转染采用的N/P比例和孵育时间通过实验进行优化，以获得更高的递送效率。最后，功能化的CAR-Jurkat细胞和CAR-T细胞分别与CD19-K562细胞共孵育，刺激IFN-γ和IL-2的分泌增加，实现对靶细胞的免疫杀伤功能。
　　2.由于上述磷酸酯聚合物载体研究的成功开展，我们进一步尝试合成磷的同族临近元素——砷的聚合物载体，用于抗肿瘤研究。砷(As)剂结合维甲酸(retinoic acid，RA)对人早幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukemia，APL)的协同治疗效应已经获得证实。然而，这些药物在临床应用的过程中仍存在一些问题函待解决。例如维甲酸较低的水溶性，以及砷剂较高毒性可能带来的毒副作用。本研究中，我们通过环氧砷烷(2-chloro-1，3，2-dioxaarsolane，CDA)的开环酯化反应，与RA及聚乙二醇结合，获得了一种双亲性的前体药物分子PEG-As-RA。该分子可以在水相中自组装成纳米颗粒，同时装载As和RA，并拥有很好的水溶性和生物相容性。另外，它们在生理缓冲液中具有较好的稳定性，可被APL细胞高效的摄取。体内成像结果显示，纳米颗粒拥有较长的血液循环时间，在水解后，可释放As和RA，发挥对APL的协同治疗效应。该有机砷-维甲酸分子为APL治疗提供了一个有前景的治疗策略。
　　3.膀胱癌的治疗技术近二十年进展较慢。其治疗方法和手段仍有改进的空间。CRISPR技术介导的基因治疗为膀胱癌治疗提供了一个新的选择。本研究中，我们开发了一个新颖的基于多肽的配体靶向脂质体系统，用于递送CRISPR-Cas13a基因线路进入膀胱癌细胞中，并且可以通过荧光成像进行监控。经过体外研究和小鼠膀胱灌注研究显示，该系统展示出了5个优势:(1)CRISPR-Cas13a是一个转录水平靶向和剪切的基因编辑工具，不会影响细胞基因组的稳定性;(2)制备的脂质体系统具有靶向人VEGFR2的能力，该标志物在膀胱癌细胞中经常高表达;(3)CRISPR-Cas13a序列由一个改造的肿瘤特异性启动子驱动以获得进一步靶向的能力;(4)引入近红外光敏剂，用于近红外光控递送系统的释放;(5)质粒中包括了靶向VEGFR2、Bcl-2、survivin三个基因的crRNA串联序列，以实现多重靶向和进一步提高治疗效果。该脂质递送系统具有光控释放能力，为膀胱癌治疗提供了一种多功能的治疗新策略。