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随着纳米技术在材料学、免疫学和生物医学等学科中的广泛应用，抗原及药物纳米递送系统得到了快速发展。其中，多糖类纳米材料具有生物相容性好、可降解、低毒和易改造等优点，吸引了众多关注。本论文将重点针对基于葡聚糖的纳米载体在EV71灭活病毒疫苗中的应用，以及基于壳聚糖/透明质酸的纳米药物在与靶向HER2的CAR-NK细胞联合治疗乳腺癌中的应用展开深入研究。
EV71是引起手足口病的主要病原体之一，目前疫苗是预防EV71传播和降低手足口病发病率最有效的手段。近年来的研究显示，体液免疫和细胞免疫在抗EV71病毒的免疫应答中均发挥了重要作用。而目前上市的EV71疫苗仅能诱导体液免疫，无法诱导细胞免疫。为研发一种具有全面保护效果的EV71疫苗，我们首先利用羧甲基葡聚糖(carboxymethylβ-glucaan，CMG)和鱼精蛋白硫酸盐(protamine sulfate，PS)通过自组装的方式构建了空纳米颗粒，确定了最佳的包装比例，进而利用该纳米颗粒包载CpG-ODN和EV71灭活病毒构建抗EV71纳米疫苗(ECNP)，并用激光粒度仪和电镜等对纳米疫苗进行表征。结果显示，在最优包装条件下，纳米疫苗尺寸均匀，分散效果好，包载效率高。在体外模拟的溶酶体环境中，纳米疫苗可以长期持久的释放抗原和佐剂，显示出纳米疫苗的缓释作用。在血清环境下，ECNP可以保护CpG-ODN免受核酸酶的降解。此外，纳米疫苗可以通过Dectin-1受体靶向递送到树突状细胞(Dendritic cells，DC)中，提高了疫苗激活免疫应答的效率。之后，我们比较了纳米疫苗与ENP(纳米颗粒包载EV71灭活病毒)、EC(EV71灭活病毒与CpG-ODN物理混合)、EV(EV71灭活病毒)疫苗组在小鼠体内的免疫效果，同时设置注射PBS和NP(空纳米颗粒)组作为阴性对照。在免疫后0、2、4、6、8、10周收集各组免疫小鼠血清，应用ELISA的方法对EV71特异性抗体效价与抗体分型进行了检测。研究结果显示纳米疫苗组诱导的抗EV71特异性抗体水平显著高于其他各组，并且以IgG2a亚型为主，证明免疫反应偏向Thl型。此外，小鼠IFN-α与IFN-γ的检测结果表明，IFN-α与IFN-γ分泌仅在纳米疫苗免疫的小鼠中显著上升，说明纳米疫苗可以诱导较为强烈的细胞免疫反应。实验终点时处死小鼠取其主要组织做H&E染色，H&E结果显示纳米疫苗免疫组小鼠的重要组织器官形态与其他各组无异，说明纳米疫苗的安全性良好。最后，将纳米疫苗小鼠免疫血清与活病毒混合，在体内与体外进行了抗体中和活性的评估，纳米疫苗组均体现出最好的免疫保护效果，对接种EV71病毒的小鼠起到了100％的保护。综上实验结果说明，这种基于葡聚糖载体的纳米疫苗具有良好的生物相容性，可靶向DC并诱导高效的抗EV71病毒的特异性体液免疫与细胞免疫应答。
乳腺癌在全球女性癌症发病率排名中占第一位，其中HER2阳性的乳腺癌复发率高，预后效果差，目前还没有理想有效的治疗方法。纳米药物及CAR-T/NK细胞在肿瘤的治疗中均取得了重大进展，但关于纳米药物与CAR-NK细胞的抗肿瘤联合免疫疗法的研究依然鲜见报道。因此，本论文继而利用壳聚糖(Chitosan，CS)和透明质酸(Hyaluronic Acid，HA)通过自组装的方式包载阿霉素(doxorubicin，DOX)构建了纳米药物DNP，并对DNP的材料性质进行了表征分析。之后，我们成功构建出两种基于HER2亲合体(Affibody)的嵌合抗原受体(Chimeric Antigen Receptor，CAR)结构和一种基于单链抗体(Single-chain antibody variable fragment，ScFv)的CAR结构质粒，包装出相应的慢病毒并成功转染NK-92MI细胞，得到Affi1CAR-NK、Affi2CAR-NK和ScFv CAR-NK三种靶向HER2的CAR-NK细胞系。通过流式检测、免疫荧光与WB实验均检测到了CAR结构的稳定表达。进一步，我们比较了三种CAR-NK细胞对HER2阳性乳腺癌的杀伤效果，三种CAR-NK细胞均可对HER2阳性乳腺癌细胞系特异性杀伤，并且基于亲合体构建的CAR-NK细胞杀伤效果丝毫不逊于以ScFv为胞外识别区的CAR-NK细胞。经过筛选，10Gy的剂量辐照最为适合今后临床实验的要求，此剂量辐照后的CAR-NK细胞可在4天内全部死亡。辐照24h后，CAR-NK细胞的细胞毒性与细胞因子分泌水平均大幅下降，进一步提示在使用CAR-NK细胞的治疗过程中需要用其他手段提高疗效。最后，我们开展了由壳聚糖/透明质酸包载的DOX纳米颗粒DNP与Affi1CAR-NK细胞联合治疗乳腺癌的研究。
用DNP预先处理SKBR3细胞后，其更易被Affi1CAR-NK细胞杀伤，这种作用在未修饰的NK细胞中同样存在。DNP的联用大幅提高了NK细胞的杀伤效果，体外杀伤实验的结果初步证实该联合治疗方法的优越性。之后进行了体内动物实验，DNP+CAR-NK(I)(辐照)组小鼠的肿瘤在实验终点时已完全消退，优于单独使用DNP组或CAR-NK(I)组的治疗效果。通过对实验终点时对细胞辐照与未辐照组小鼠外周血做流式检测，可以发现未辐照组小鼠体内仍有过继细胞残留，由此证实辐照是未来临床中必不可少的步骤。小鼠重要组织H&E染色结果显示，Affi1CAR-NK细胞和DNP均未对小鼠重要组织器官造成损伤，在治疗期间，各组小鼠的体重无明显差异，说明DNP联合Affi1CAR-NK细胞的安全性良好。综上，由壳聚糖/透明质酸组装的DNP纳米药物与CAR-NK细胞联合治疗乳腺癌的效果显著，为肿瘤免疫联合治疗在临床上的应用提供了新思路。
EV71是引起手足口病的主要病原体之一，目前疫苗是预防EV71传播和降低手足口病发病率最有效的手段。近年来的研究显示，体液免疫和细胞免疫在抗EV71病毒的免疫应答中均发挥了重要作用。而目前上市的EV71疫苗仅能诱导体液免疫，无法诱导细胞免疫。为研发一种具有全面保护效果的EV71疫苗，我们首先利用羧甲基葡聚糖(carboxymethylβ-glucaan，CMG)和鱼精蛋白硫酸盐(protamine sulfate，PS)通过自组装的方式构建了空纳米颗粒，确定了最佳的包装比例，进而利用该纳米颗粒包载CpG-ODN和EV71灭活病毒构建抗EV71纳米疫苗(ECNP)，并用激光粒度仪和电镜等对纳米疫苗进行表征。结果显示，在最优包装条件下，纳米疫苗尺寸均匀，分散效果好，包载效率高。在体外模拟的溶酶体环境中，纳米疫苗可以长期持久的释放抗原和佐剂，显示出纳米疫苗的缓释作用。在血清环境下，ECNP可以保护CpG-ODN免受核酸酶的降解。此外，纳米疫苗可以通过Dectin-1受体靶向递送到树突状细胞(Dendritic cells，DC)中，提高了疫苗激活免疫应答的效率。之后，我们比较了纳米疫苗与ENP(纳米颗粒包载EV71灭活病毒)、EC(EV71灭活病毒与CpG-ODN物理混合)、EV(EV71灭活病毒)疫苗组在小鼠体内的免疫效果，同时设置注射PBS和NP(空纳米颗粒)组作为阴性对照。在免疫后0、2、4、6、8、10周收集各组免疫小鼠血清，应用ELISA的方法对EV71特异性抗体效价与抗体分型进行了检测。研究结果显示纳米疫苗组诱导的抗EV71特异性抗体水平显著高于其他各组，并且以IgG2a亚型为主，证明免疫反应偏向Thl型。此外，小鼠IFN-α与IFN-γ的检测结果表明，IFN-α与IFN-γ分泌仅在纳米疫苗免疫的小鼠中显著上升，说明纳米疫苗可以诱导较为强烈的细胞免疫反应。实验终点时处死小鼠取其主要组织做H&E染色，H&E结果显示纳米疫苗免疫组小鼠的重要组织器官形态与其他各组无异，说明纳米疫苗的安全性良好。最后，将纳米疫苗小鼠免疫血清与活病毒混合，在体内与体外进行了抗体中和活性的评估，纳米疫苗组均体现出最好的免疫保护效果，对接种EV71病毒的小鼠起到了100％的保护。综上实验结果说明，这种基于葡聚糖载体的纳米疫苗具有良好的生物相容性，可靶向DC并诱导高效的抗EV71病毒的特异性体液免疫与细胞免疫应答。
乳腺癌在全球女性癌症发病率排名中占第一位，其中HER2阳性的乳腺癌复发率高，预后效果差，目前还没有理想有效的治疗方法。纳米药物及CAR-T/NK细胞在肿瘤的治疗中均取得了重大进展，但关于纳米药物与CAR-NK细胞的抗肿瘤联合免疫疗法的研究依然鲜见报道。因此，本论文继而利用壳聚糖(Chitosan，CS)和透明质酸(Hyaluronic Acid，HA)通过自组装的方式包载阿霉素(doxorubicin，DOX)构建了纳米药物DNP，并对DNP的材料性质进行了表征分析。之后，我们成功构建出两种基于HER2亲合体(Affibody)的嵌合抗原受体(Chimeric Antigen Receptor，CAR)结构和一种基于单链抗体(Single-chain antibody variable fragment，ScFv)的CAR结构质粒，包装出相应的慢病毒并成功转染NK-92MI细胞，得到Affi1CAR-NK、Affi2CAR-NK和ScFv CAR-NK三种靶向HER2的CAR-NK细胞系。通过流式检测、免疫荧光与WB实验均检测到了CAR结构的稳定表达。进一步，我们比较了三种CAR-NK细胞对HER2阳性乳腺癌的杀伤效果，三种CAR-NK细胞均可对HER2阳性乳腺癌细胞系特异性杀伤，并且基于亲合体构建的CAR-NK细胞杀伤效果丝毫不逊于以ScFv为胞外识别区的CAR-NK细胞。经过筛选，10Gy的剂量辐照最为适合今后临床实验的要求，此剂量辐照后的CAR-NK细胞可在4天内全部死亡。辐照24h后，CAR-NK细胞的细胞毒性与细胞因子分泌水平均大幅下降，进一步提示在使用CAR-NK细胞的治疗过程中需要用其他手段提高疗效。最后，我们开展了由壳聚糖/透明质酸包载的DOX纳米颗粒DNP与Affi1CAR-NK细胞联合治疗乳腺癌的研究。
用DNP预先处理SKBR3细胞后，其更易被Affi1CAR-NK细胞杀伤，这种作用在未修饰的NK细胞中同样存在。DNP的联用大幅提高了NK细胞的杀伤效果，体外杀伤实验的结果初步证实该联合治疗方法的优越性。之后进行了体内动物实验，DNP+CAR-NK(I)(辐照)组小鼠的肿瘤在实验终点时已完全消退，优于单独使用DNP组或CAR-NK(I)组的治疗效果。通过对实验终点时对细胞辐照与未辐照组小鼠外周血做流式检测，可以发现未辐照组小鼠体内仍有过继细胞残留，由此证实辐照是未来临床中必不可少的步骤。小鼠重要组织H&E染色结果显示，Affi1CAR-NK细胞和DNP均未对小鼠重要组织器官造成损伤，在治疗期间，各组小鼠的体重无明显差异，说明DNP联合Affi1CAR-NK细胞的安全性良好。综上，由壳聚糖/透明质酸组装的DNP纳米药物与CAR-NK细胞联合治疗乳腺癌的效果显著，为肿瘤免疫联合治疗在临床上的应用提供了新思路。