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目的:研究反应氧族(Reactive oxygen specise,ROS)激活神经细胞保护性自噬的作用和机制,探讨一种水溶性槲皮素耦合物通过该机制对永久性脑缺血损伤的保护作用。方法:(1)用不同浓度H2O2处理PC12细胞和SH-SY5Y细胞,探究在不同浓度H2O2处理下,细胞线粒体ROS含量与线粒体自噬、细胞存活之间的关系。MTT法检测不同浓度(3、6、12、25、50、100、200、300、400、500μmol/L)H2O2处理PC12细胞1h、3h、6h、12h、24h后细胞存活率,处理SH-SY5Y细胞6h的细胞存活率;流式细胞术检测不同浓度(12、25、50、100、200μmol/L)H2O2处理PC12细胞和SH-SY5Y细胞6h后总ROS含量、线粒体ROS含量、细胞凋亡率、细胞增殖标志物Ki67的表达、线粒体自噬标志物PINK1的表达;激光共聚焦检测LC3、PINK1与线粒体的共定位;光学显微镜观察细胞形态变化;MTT法检测Mdivi-1处理后,正常组和H2O2处理组的细胞存活率。免疫印迹法检测不同浓度H2O2及相关抑制剂对TFEB、HIF-1α、AKT、m TOR、PINK1、Parkin、P62表达的影响。激光共聚焦荧光显微镜检测100μmol/L H2O2对TFEB、HIF-1α细胞分布的影响。(2)探讨水溶性槲皮素耦合物透明质酸-槲皮素(Hyaluronic acid-quercetin,HA-QT)对拟缺血损伤细胞和永久性脑缺血动物的保护作用。MTT法检测不同浓度HA-QT对细胞活力的影响;用200μmol/L H2O2造模拟缺血损伤,MTT法检测HA-QT对H2O2损伤细胞的保护作用;流式细胞术检测HA-QT对H2O2损伤细胞凋亡率、线粒体ROS含量的影响;激光共聚焦检测HA-QT对H2O2损伤细胞PINK1/Parkin线粒体自噬及TFEB细胞分布的影响;采用线栓法制作大鼠永久性脑缺血模型,缺血2h时,尾静脉注射2.5mg/Kg、5mg/Kg、7.5mg/Kg HA-QT,腹腔注射5mg/Kg QT,4h后进行TTC染色和行为学评分检测;免疫组化法检测缺血脑区CD44和透明质酸酶1的表达变化;试剂盒检测缺血侧大脑皮层H2O2含量、总ROS含量、超氧阴离子(O2·-)含量,以及过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)的变化。(3)进一步研究脑靶向修饰后,SS31-HA-QT对神经保护的作用及机制。MTT法检测不同浓度SS31-HA-QT对细胞活力的影响;对比QT、HA-QT及SS31-HA-QT对H2O2损伤细胞存活率的影响;制作体外血脑屏障模型,检测其TEER值;检测荧光标记后SS31-HA-QT-IR780的细胞摄取;体外实验和在体实验对比SS31-HA-QT-IR780和HA-QT-IR780透过血脑屏障的能力;TTC染色检测SS31-HA-QT对永久性脑缺血模型的保护作用;HE和Nissl染色检测SS31-HA-QT对脑组织缺血损伤病理变化的影响;在体实验检测SS31-HA-QT及相关抑制剂对TFEB、HIF-1α、PINK1、Parkin、LC3表达的影响;离体实验检测SS31-HA-QT及相关抑制剂对AKT、m TOR、TFEB、HIF-1α、PINK1、Parkin、P62、LC3表达的影响。结果:(1)不同程度H2O2刺激可以引起细胞不同应答反应。轻度氧化应激(外源性加入H2O2<25μmol/L),对细胞增殖、凋亡、ROS含量无显著影响。适度氧化应激(外源性加入50-100μmol/L H2O2)时,细胞ROS含量增加,细胞增殖增加、凋亡增加、PINK1/Parkin介导的线粒体自噬激活。其中,50μmol/L H2O2只激活细胞增殖,对凋亡无显著影响;而100μmol/L H2O2可同时促进细胞增殖和凋亡,此时抑制自噬后,细胞存活率减少,表明此条件激活的线粒体自噬有保护作用,且TFEB、HIF-1α、AKT、m TOR参与该保护作用。重度氧化应激(外源性加入>200μmol/L H2O2)时,线粒体ROS含量进一步增加,细胞凋亡增加,增殖抑制,PINK1/Parkin介导的线粒体自噬增加。(2)200μmol/L H2O2处理细胞6h后,细胞存活率在60%左右,表明细胞氧化应激损伤模型制作成功。HA-QT可以提高H2O2损伤细胞细胞存活率,增加细胞线粒体自噬水平,降低细胞凋亡率,加入抗氧化剂NAC、自噬抑制剂3-MA及线粒体自噬抑制剂Mdivi-1可以显著逆转HA-QT的作用。HA-QT促进H2O2损伤细胞TFEB核转移,且该作用可以被NAC逆转,但3-MA及Mdivi-1对该作用无显著影响。脑缺血6h后,缺血脑区CD44、透明质酸酶1表达增加;与模型组相比,缺血2h时给药,药物治疗4h后,大鼠神经功能显著改善,梗死体积减少,抗氧化酶水平增加,氧化应激水平减低。(3)SS31-HA-QT对细胞增殖无显著影响,50-400μmol/L SS31-HA-QT对H2O2损伤细胞有保护作用,且比同浓度HA-QT及QT保护作用强;体内体外血脑屏障透过性试验表明,SS31-HA-QT的血脑屏障透过性显著优于HA-QT;SS31-HA-QT增加H2O2损伤细胞中PINK1、Parkin、P62、LC3的表达,增加TFEB、HIF-1α核转位,降低AKT、m TOR的磷酸化水平,在大鼠脑缺血模型中,SS31-HA-QT可以增加TFEB、HIF-1α、PINK1、Parkin、LC3的表达。结论:(1)适量氧化应激可以激活PINK1/Parkin线粒体自噬,发挥缺血后神经保护作用,且TFEB、HIF-1α参与该保护作用。(2)HA-QT通过降低H2O2损伤细胞及缺血脑组织的氧化应激水平,促进TFEB核转位,激活线粒体自噬,发挥保护作用。(3)SS31-HA-QT血脑屏障透过性强,能靶向线粒体降低氧化应激水平,增加TFEB、HIF-1α核转位,降低AKT、m TOR的磷酸化水平而激活PINK1/Parkin线粒体自噬发挥保护作用。