【摘 要】
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目的与背景随着社会医疗水平的发展,个体化精准医疗逐渐成为大众关注的焦点,主要指从基因角度对疾病进行筛查、诊断、预后评估和用药指导等,日渐成熟的分子诊断技术在其中占据重要组成部分。通过基于PCR扩增技术的分子诊断技术对重大传染性疾病进行早筛、对肿瘤特异性标志物进行筛查等,我们可以进行大规模的流行病学调查和分析以及制定个性化的治疗方案,这对提高我国整体人口健康水平影响深远。但是现阶段基于PCR的核酸扩
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目的与背景随着社会医疗水平的发展,个体化精准医疗逐渐成为大众关注的焦点,主要指从基因角度对疾病进行筛查、诊断、预后评估和用药指导等,日渐成熟的分子诊断技术在其中占据重要组成部分。通过基于PCR扩增技术的分子诊断技术对重大传染性疾病进行早筛、对肿瘤特异性标志物进行筛查等,我们可以进行大规模的流行病学调查和分析以及制定个性化的治疗方案,这对提高我国整体人口健康水平影响深远。但是现阶段基于PCR的核酸扩增技术仍存在一定问题,样本处理后的大规模核酸提取费时费力,且RNA靶标在提取过程中易发生降解或者断裂,一定程度上限制了检测的灵敏度;受仪器荧光检测通道的制约,PCR扩增重数受到限制等。综上所述,一种灵敏特异的无需核酸提取的核酸检测技术可以解决分子诊断现存的一些问题,本研究将一种高特异性、高灵敏度、基于捕获和连接的核酸检测方法加以创新改进,应用到儿童白血病融合基因和人体免疫缺陷病毒的检测中,成功的实现了这两种疾病的高通量核酸检测及定量研究。方法本研究将免提核酸的、灵敏特异的基于捕获和连接的PCR核酸检测技术方法应用到儿童白血病中融合基因的定性定量检测,同时我们用市面上现有的普通RT-PCR试剂盒对融合基因体外转录合成RNA(in vitro translation RNA,IVT-RNA)和病人血液样品进行平行检测,通过方法学的比较评估了此方法的灵敏度和特异性,然后对来自首都医科大学附属北京儿童医院的50例急性淋巴细胞白血病患儿样本,进行检测验证。在PCR的基础之上,我们运用MALDI-TOF质谱分析初步建立了一种基于捕获和连接的多重融合基因质谱分析技术,随后用IVT-RNA对方法的可行性进行评估。此外,本研究将一种基于捕获和连接的核酸检测技术方法应用到链霉亲和素包裹的磁珠上,结合LAMP(loop-mediated isothermal amplif-ication)恒温扩增建立起了一种免核酸提取的、灵敏高效的基于磁珠捕获和连接的环介导恒温扩增(capture and ligation probe-LAMP,CLIP-LAMP)方法体系,该体系用于传染性疾病HIV IVT-RNA的定性及定量检测,同时评估该体系的灵敏度和特异性。结果本研究成功将基于96孔板的CLIP-PCR核酸检测技术应用到儿童急性淋巴细胞白血病中融合基因的检测,针对两种种常见的融合基因BCR-ABL1和ETV6-RUNX1进行定性定量和双重检测,BCR-ABL1可以稳定检测到192 copies,ETV6-AUNX1可以稳定检测到24.24 copies,用普通RT-PCR试剂盒进行方法学比较可以得到相同的检出限。我们还进一步联合CLIP-PCR和核酸质谱方法对BCR-ABL1和ETV6-RUNX1这两种融合基因进行多重检测初步可行性分析,实验结果证明,该方法成功应用于多重融合基因的检测,检测结果良好。除此之外,本研究构建的基于磁珠捕获和连接的环介导恒温扩增方法体系成功的应用到重大传染性疾病HIV的定性与定量检测中,并且可以稳定检测到32 CPs/μL的病毒载量,检测方法具有良好的特异性,且具有处理>1 mL的大体积样本的可能,整个反应可以控制在2h内完成。结论本研究在基于捕获和连接的核酸检测技术基础上,将其与磁珠上的恒温扩增及捕获板里的PCR扩增方法体系相结合,成功建立起了免核酸提取的RNA为靶标的定性与定量检测技术,并应用于血液肿瘤里融合基因和HIV的检测。通过对结果分析证明,基于96孔板捕获和连接的PCR扩增和核酸质谱方法体系,应用于融合基因的定性定量检测,取得了较高的灵敏度和特异性;基于磁珠捕获和连接的环介导恒温扩增方法体系可以特异性的捕获RNA靶标并进行高效扩增,有潜力成为一种灵敏高效、简便快捷的边境地区HIV筛查技术。综上所述,基于捕获和连接的核酸检测方法在儿童血液肿瘤里融合基因和人体免疫缺陷病毒上的应用取得成功,同时为其他疾病的检测提供了新的方法和思路。
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