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脑胶质瘤是一类恶性程度较高，具有高侵袭性，高复发率及高致死率的疾病。近年来，虽然胶质瘤的诊断治疗得到不断的增强。但其患者的预后仍未得到明显的改善。近年来，人们对胶质瘤的发病机制阐述逐渐深入发现，大部分胶质瘤的发生发展中，RB，PI3K，P53这3条通路的异常改变参与其中。因此，寻找该调控网络关键调控分子，抑制胶质瘤的形成与发展，从而为临床提供准确有效的治疗靶标，目前已成为了神经外科领域所关注的热点问题。RTN4是网状蛋白家族的成员之一，包含三个剪切变体：RTN4A，RTN4B，RTN4C，每个剪切变体在不同的细胞中发挥不同的生物学功能，广泛地参与了细胞分化成熟，增殖，凋亡，迁移，粘附，侵袭等各项功能的调控。既往研究认为，RTN4在胶质瘤中属于肿瘤抑制基因，其剪切变体RTN4A，RTN4B，RTN4C均有报道在细胞生长中起抑制作用，但目前有实验证实，RTN4A在胶质瘤中普遍存在表达，部分甚至存在过表达。作为肿瘤抑制基因，为何会在胶质瘤中过表达，其对肿瘤发生发展的功能影响及意义仍不为人知。回顾文献，目前关于RTN4及胶质瘤恶性生物学行为如增殖凋亡，侵袭迁移方面的研究较少。因此本实验拟从组织水平、细胞水平和动物水平，通过定量RT-PCR、慢病毒RNA干扰，MTT增殖曲线，克隆形成，细胞周期等方法，研究RTN4及其剪切变体调节脑胶质瘤恶性生物学特性的病理机制。第一部分：RTN4在脑胶质瘤组织和细胞系中的表达及与病理类型的关系目的：RTN4是网状蛋白家族的成员之一，其广泛地参与了细胞的各种生物学行为的调控过程。但是目前，关于RTN4在胶质瘤中的表达情况仍不为人知。本部分利用实时定量RT-PCR的方法，研究RTN4在脑胶质瘤组织和U251，U87，U373，A172细胞系中的表达，并探索RTN4表达量与胶质瘤病理级别及组织类型的相关性。方法：1）收集病理证实（参照2007WHO中枢神经系统肿瘤诊断分类标准）为胶质瘤的临床液氮冻存标本10例（I级1例，II级2例，III级3例，IV级4例），采用实时定量RT-PCR方法检测各例标本中RTN4mRNA的表达量，分析其与病理级别及组织类型的相关性。2）利用实时定量RT-PCR检测RTN4mRNA在A172，U373，U251和U87胶质瘤细胞株中的表达，比较胶质瘤细胞系中RTN4的表达变化。结果：在胶质瘤标本中，RTN4表达普遍存在，部分标本中，RTN4呈现明显的过表达。通过半定量RT-PCR方法，与内参β-actin蛋白比较，3例低级别胶质瘤平均表达水平为1.76±1.44，7例高级别胶质瘤平均表达水平为2.34±2.53。RTN4在高低级别胶质瘤中的表达无明显统计学差异。少突胶质瘤细胞（4.67±4.75）与星形胶质瘤细胞（1.54±0.85）之间的RTN4表达差异存在统计学意义。在四组胶质瘤细胞系中，RTN4亦存在表达，但四组胶质瘤细胞系间RTN4表达具有明显差异（P<0.05），两两细胞系之间的RTN4表达均不相同。结论：在胶质瘤标本及细胞系中，均存在RTN4表达，部分标本或细胞系中，RTN4存在明显过表达。RTN4表达与胶质瘤病理等级无明显关联。然而在胶质瘤的组织类型上存在差异。作为肿瘤抑制因子，其在肿瘤中的表达增加的意义和作用以及其在肿瘤组织类型上的鉴别意义有待我们继续研究证实。第二部分：构建靶向RTN4的干扰shRNA慢病毒载体目的：前期实验我们证实，RTN4在胶质瘤组织标本及细胞系中存在不同程度的表达，部分过表达，然而，一个抑癌基因其在肿瘤中高表达的作用仍是未知。为了探寻RTN4在胶质瘤中的作用，我们拟先建立shRNA稳定干扰RTN4表达病毒载体。方法：1）利用shRNA设计软件，选取合适的shRNA序列，采用基因重组技术插入质粒。将质粒转化入细胞表达扩增。2）对建立的shRNA质粒进行测序，并且将其转染U251细胞系，通过RT-PCR观察其对RTN4表达的抑制情况结果：根据siRNA设计原则，设计shRNA序列及shCON序列，成功将其插入pGPU6/GFP/Neo质粒中。将其转染胶质瘤细胞U251细胞系后测序证实RNA干扰质粒中shRNA干扰序列与设计一致。RT-PCR实验证实，转染shRNA的U251细胞与转染shCON的细胞相比，RTN4mRNA的表达明显下降（P<0.05）。结论：在本实验中成功地构建了可稳定干扰RTN4mRNA表达的慢病毒载体。第三部分：RTN4调控胶质瘤细胞恶性生物学行为的实验研究目的：RTN4广泛参与多种细胞生物学行为的调控过程。前期实验证实RTN4在胶质瘤中呈现过表达。但其在胶质瘤中具体发挥的功能仍是未知。本部分采用稳定改变内源性RTN4表达水平的RNA干扰慢病毒载体，研究RTN4对于脑胶质瘤恶性生物学行为的作用。方法：靶向RTN4稳定RNA干扰载体转染胶质瘤U251、U87及U373细胞，采用RT-PCR验证干扰的有效性。采用MTT法检测细胞生长曲线变化，克隆形成实验检测细胞的克隆形成能力改变，通过流式细胞技术检测细胞周期的变化。继而通过WesternBlot实验检测RTN4可能调控的下游分子的表达变化。结果：使用shRNA干扰胶质瘤细胞内的RTN4mRNA表达，U251，U87及U373胶质瘤细胞的增殖能力下降，克隆形成能力减弱。细胞周期实验发现，RTN4表达下降后，U251细胞的细胞周期被阻断于G0/G1期，进入分裂期的细胞数明显减少。Western Blot检测9种细胞周期相关蛋白发现，RTN4下调伴随着CDK4及CDC25A的下调及p21的上调。其余蛋白的表达无显著变化。结论：RTN4能够通过调控细胞周期，影响胶质瘤细胞的增殖过程，在该过程中，RTN4可能通过下调CDK4及CDC25A，上调p21发挥作用。