【摘 要】
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ERA1（ENHANCED RESPONSE TO ABSCISIC ACID 1）,编码蛋白质法尼基转移酶（protein farnesyltransferase简称PFT）β亚基,因其对ABA的响应增强了种子休眠和气孔关闭以及相应突变体的抗旱性而命名,又叫WIG或FTB。PFT催化15碳的法尼基焦磷酸（farnesyl pyrophosphate,简称FPP）和底物蛋白碳末端Cys残基之间形成
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ERA1（ENHANCED RESPONSE TO ABSCISIC ACID 1）,编码蛋白质法尼基转移酶（protein farnesyltransferase简称PFT）β亚基,因其对ABA的响应增强了种子休眠和气孔关闭以及相应突变体的抗旱性而命名,又叫WIG或FTB。PFT催化15碳的法尼基焦磷酸（farnesyl pyrophosphate,简称FPP）和底物蛋白碳末端Cys残基之间形成硫醚键,这种翻译后的修饰会促进蛋白质-蛋白质或蛋白质-膜的相互作用,是真核生物中调节蛋白质的活性、亚细胞定位的一种保守机制。ERA1已被证明在不同的生物过程中具有多效性作用,如免疫反应、热激反应、激素反应、生长和发育调节,目前ERA1主要针对其ABA敏感性进行研究的。ERA1表型的多样性反映了PFT靶向蛋白质的多样性。矮牵牛发育调控的分子机制与拟南芥有所不同,因此研究PhERA1基因不仅有助于认识其在不同物种间的功能差异以及基因重复后的功能分化,而且有助于了解蛋白质法尼基化在矮牵牛生长发育中的作用。矮牵牛因其观赏价值高、易于栽培、遗传背景清晰、分子生物学方法和手段成熟,被视为植物分子生物学研究的模式植物之一,本文通过构建矮牵牛PhERA1基因的超表达和定点敲除载体,并对超表达植株和突变体植株的表型以及抗旱处理进行分析,初步解析PhERA1基因在矮牵牛生长发育中的作用。主要研究成果如下:1.矮牵牛PhERA1基因的克隆和生物信息学分析利用PCR法从矮牵牛cDNA中克隆得到PhERA1基因的CDS序列,其编码446个氨基酸,在NCBI上进行Blast protein分析,PhERA1基因含有FTase结构域,属于异戊二烯转移酶家族蛋白。系统进化树显示其与烟草亲缘关系较近。2.矮牵牛PhERA1基因组织特异性分析通过实时荧光定量PCR分析了PhERA1基因在矮牵牛根、茎、叶、花、果五个器官中的表达量,发现其在所有的器官中都有表达,在花中表达量最高,其次是茎,在叶片中表达量最低;对花器官的不同时期进行定量分析,结果表明其在小花蕾中的表达量较高;对花器官的不同部位进行定量分析,结果表明其在萼片和花瓣中表达量较高。3.矮牵牛PhERA1基因超表达载体构建以及超表达植株表型分析将PhERA1基因的CDS序列连接到表达载体p CAMBIA2301G上,构建超表达载体,通过农杆菌侵染法转化矮牵牛、拟南芥。经过kan筛选和DNA分子水平鉴定得到超表达植株并通过实时荧光定量PCR得到表达量高的株系用于表型观察。与野生型相比,组培瓶中的矮牵牛超表达植株表现出叶片卷曲狭长,移栽出去的矮牵牛叶片、开花时间以及花的形态与野生型无明显区别。超表达拟南芥OE-3株系表现出提前抽薹开花,其余株系没有明显的表型。这可能与法尼基化靶向蛋白的精确调节或者法尼基二磷酸、α亚基的可用性有关,也有可能是杂合子,性状还不稳定。4.矮牵牛PhERA1基因定点敲除载体构建以及突变体植株表型分析在PhERA1基因第二个外显子上选择一个靶点,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建敲除载体,通过农杆菌介导的叶盘法转化矮牵牛,经过basta筛选和PCR鉴定得到突变体植株,选择五个突变株系用于表型观察和数据统计。在组培苗期间,与野生型相比,突变体植株表现出生长发育缓慢,叶片狭小且卷曲,根系较长但侧根数量少,对外源ABA敏感以及抗旱性增强等表型,出现这些表型的原因可能与矮牵牛体内法尼基化靶向的蛋白有关。
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