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伪狂犬病毒(Pseudorabies Virus，PRV)、猪细小病毒（Porcine parvovirus, PPV）、猪圆环病毒2型（Porcine circovirus Type2, PCV2）是危害当今养猪业的三种重要病原，分别引起猪的伪狂犬病、猪细小病毒病与猪圆环病毒2型病。猪伪狂犬病和猪细小病毒病是以引起猪群发生繁殖障碍为特征的传染病，在我国很多猪场流行，严重制约了养猪业的发展。猪圆环病毒2型与猪多种疾病综合征有关，尤以仔猪断奶后多系统衰弱综合征危害最大，目前呈世界性分布，给养猪业生产造成了巨大的经济损失。伪狂犬病毒具有宿主范围广、不感染人、基因组容量大，含多个可缺失的非必需基因、重组病毒稳定的特点，加之猪伪狂犬病病毒基因缺失疫苗的成功应用，以PRV为载体表达其它病原主要免疫原性蛋白质构建重组伪狂犬病毒成为基因工程疫苗的研究热点，尤以PRV-Bac系统最为便捷。本研究在TK基因缺失的PRV ZJ株Bac的基础上插入PPV VP2和PCV2Cap基因，旨在研制PRV、PPV、PCV2三联基因工程疫苗，通过口蹄疫病毒2A基因将PPV VP2基因和PCV2Cap基因串联，得到VP2-2A-Cap（V2C）基因，将其插入pEP-CMV-in转移载体构建pEP-V2C-in重组表达质粒，再通过Red E/T两步重组法构建了pPRV-V2C-ΔgE和pPRV-ΔgE突变体，该突变体用磷酸钙法转染BHK-21细胞获得重组病毒rPRV-V2C-ΔgE和rPRV-ΔgE。Western blot分析表明rPRV-V2C-ΔgE能在BHK-21细胞内表达融合蛋白VP2-2A-Cap，且目的蛋白能被2A蛋白裂解为64ku和28ku两个片段。重组病毒生长曲线和噬斑大小测定结果显示rPRV-V2C-ΔgE在BHK-21细胞中的增殖滴度与亲本株rPRV无显著差异，表明外源基因的插入不影响rPRV的增殖。本研究为PRV、PPV和PCV2三联重组活载体疫苗的研制奠定了基础。