【摘 要】
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目的不孕症是一个重要的全球人类健康问题,近一半的病例与男性因素有关。氧化应激（Oxidative stress,OS）指细胞内活性氧（Reactive oxygen species,ROS）的生成与清除失去平衡所致的一种细胞损伤状态,越来越多的证据表明,OS在男性不育的发生中起着独立的作用。弱精子症精液中ROS水平升高,是天然的适用于研究精子OS的研究对象。核因子E2相关因子2（nuclear f
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目的不孕症是一个重要的全球人类健康问题,近一半的病例与男性因素有关。氧化应激（Oxidative stress,OS）指细胞内活性氧（Reactive oxygen species,ROS）的生成与清除失去平衡所致的一种细胞损伤状态,越来越多的证据表明,OS在男性不育的发生中起着独立的作用。弱精子症精液中ROS水平升高,是天然的适用于研究精子OS的研究对象。核因子E2相关因子2（nuclear factor erythroid 2 related factor 2,Nrf2）是调节细胞OS的一个重要的转录因子。通常情况下,胞质中的Nrf2与其抑制因子如Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1（Kelch-like ECH-associated protein 1,Keap1）解离后进入细胞核,再经历一系列变化后可激活一系列抗氧化基因的表达。过氧化物酶6（peroxiredoxin 6,PRDX6）是维持人类精子活力和DNA完整性的主要抗氧化酶。研究发现Nrf2在晶状体上皮细胞及A549细胞（肺源性细胞系）中调控PRDX6的表达,激活抗氧化系统抵抗OS,但目前Nrf2在精子细胞中对PRDX6的作用尚未见相关报道。本课题通过研究OS损伤中精子细胞中Nrf2和PRDX6的表达变化及Nrf2对PRDX6的影响,探索精子细胞应对OS的可能的分子调控机制,希望揭示Nrf2和PRDX6在精子抗氧化系统中的重要作用,为男性不育的抗氧化治疗提供新的思路。方法1.选取弱精子症样本及正常精液样本作为研究对象,流式细胞术验证弱精子症样本精子ROS水平,实时荧光定量PCR（qRT-PCR）和蛋白质印记（Western Blot）检测Nrf2和PRDX6水平,观察Nrf2和PRDX6是否在OS损伤发生中起到作用。2.使用GC-2（spd）ts（GC-2）小鼠精母细胞系作为实验载体,使用0.2 mM的过氧化氢（H2O2）构建氧化应激模型,不加H2O2的一组作为对照组,qRT-PCR和Western Blot检测Nrf2和PRDX6的表达量,研究Nrf2和PRDX6在精子OS损伤发生中扮演何种角色。3.分离提取有无H2O2处理的GC-2细胞的细胞核、细胞质蛋白,Western Blot检测Nrf2和PRDX6在实验组和对照组胞质和胞核中的表达量,研究Nrf2是否通过入核的机制调控PRDX6的表达。结果1.流式细胞术结果表明弱精症组精子ROS水平升高（P＜0.05）,qRT-PCR和Western Blot结果显示Nrf2、PRDX6 mRNA和蛋白表达水平均下降（P＜0.05）,且随弱精程度的增重,上述变化更显著。2.与未添加H2O2刺激的对照组相比,qRT-PCR和Western Blot结果显示Nrf2在H2O2处理GC-2细胞中mRNA和蛋白水平表达均无明显变化（P＞0.05）,PRDX6在H2O2处理GC-2细胞中mRNA和蛋白水平表达水平均上升（P＜0.05）。3.与未添加H2O2刺激的对照组相比,Western Blot结果显示H2O2处理后胞质中Nrf2相对表达量大幅下降（1.045±0.101 vs 0.219±0.073,P＜0.001）;胞核中 Nrf2 相对表达量大幅上升（0.285±0.053 vs 0.784±0.062,P=0.001）。结论1.Nrf2和PRDX6在弱精子症患者OS损伤中具有重要作用。2.在H2O2诱导的小鼠精母细胞OS损伤中,Nrf2通过核转位激活PRDX6表达促进抗氧化保护作用。
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