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前言:胃癌是消化系统最常见的恶性肿瘤,目前其临床治疗效果仍不理想。因此,阐明胃癌发生发展的分子机制对研发新型治疗靶点、改善胃癌患者预后具有重要意义。S100A4是钙离子结合蛋白S100家族的成员之一,本课题组前期研究已证实S100A4高表达与胃癌细胞的增殖、体外迁移和凋亡等密切相关。GDF15是S100A4下游的重要基因,参与介导S100A4对胃癌细胞增殖、凋亡和干样特性的影响。MiR-3189编码基因位于GDF15基因的内含子内,目前已有研究表明miR-3189-3p在人类不同肿瘤中发挥不同的生物学功能,但在胃癌细胞中的表达状态和功能仍然未见报道。鉴于S100A4可以调控GDF15表达,我们推测S100A4可能也参与调控miR-3189-3p的表达,且miR-3189-3p可能介导S100A4对胃癌细胞MGC803的生物学特性的影响。通过生物信息学软件预测miR-3189-3p下游的靶基因,根据相关表达及功能挑选出CFL2作为候选靶基因。CFL2（cofilin-2）是肌动蛋白结合蛋白ADF/cofilins家族的成员之一。前期研究发现人体中CFL2主要在肌肉组织中表达并参与肌肉的发育和维持。而近期研究发现CFL2在多种肿瘤组织如乳腺癌、胶质母细胞瘤和胰腺癌中表达且发挥不同的生物学功能。但是迄今为止,CFL2在胃癌细胞中的作用尚未见报道。肿瘤细胞在有氧条件下依然倾向于依赖糖酵解途径获取能量的现象称为“Warburg effect”或有氧酵解,已被列为肿瘤的十大特征之一。已有研究表明有氧酵解与肿瘤的增殖和侵袭等密切相关。结合前期研究结果,我们推测miR-3189-3p可能通过影响糖代谢而影响肿瘤细胞的生物学特性。综上所述,本实验研究了miR-3189-3p对胃癌细胞MGC803生物学特性的影响;并探讨miR-3189-3p是否参与S100A4对胃癌细胞生物学特性的影响;通过生物信息学软件预测miR-3189-3p的靶基因并对其进行验证;进一步研究miR-3189-3p影响胃癌细胞MGC803生物学特性是否由其靶基因CFL2介导;评估靶基因的预后价值;初探miR-3189-3p和靶基因CFL2在胃癌细胞糖酵解中的作用。希望通过本研究认识miR-3189-3p对S100A4生物学特性的影响及其下游分子机制,为靶向S1004进行胃癌诊治提供新的依据和线索。材料与方法:1、实验材料:人胃癌细胞系MGC803、人胚肾细胞系HEK293T。2、实验方法:细胞培养,细胞瞬时转染实验,实时定量PCR检测,CCK-8实验,Transwell实验,划痕实验,体外成球实验,软琼脂集落形成实验,Western blotting检测,双荧光素酶报告基因活性检测,乳酸含量检测,乳酸脱氢酶活性检测,生存分析,统计分析。结果:1、实时定量PCR结果显示,S100A4-siRNA转染MGC803细胞48小时后,与NC-siRNA组比较,GDF15 mRNA表达水平、pri-miR-3189和miR-3189-3p表达水平均显著下调。2、CCK8细胞增殖实验结果显示,抑制miR-3189-3p表达可有效促进MGC803细胞的增殖能力;相反,过表达miR-3189-3p则有效抑制MGC803细胞的增殖能力。3、Transwell及划痕实验结果表明,过表达miR-3189-3p能够有效抑制MGC803细胞的迁移能力。4、细胞体外成球和软琼脂集落形成实验结果表明,过表达miR-3189-3p能有效抑制MGC803细胞的干细胞样特性。5、MiR-3189-3p过表达可显著增强S100A4-siRNA对MGC803细胞增殖、迁移和干样特性的抑制效应。6、生物信息学软件预测结果显示,CFL2的3’-UTR区存在mi R-3189-3p的结合位点。7、双荧光素酶报告基因活性检测结果显示,过表达miR-3189-3p可显著抑制野生型CFL2 3’-UTR的荧光素酶活性。8、实时定量PCR及Western blotting结果表明,过表达miR-3189-3p,CFL2mRNA及蛋白表达水平显著下调。9、实时定量PCR及Western blotting结果表明,MGC803细胞转染CFL2-siRNA可使CFL2 mRNA及蛋白表达水平显著下调。10、CFL2表达沉默能够有效抑制MGC803细胞的增殖和迁移能力。11、转染CFL2表达载体能有效逆转miR-3189-3p对MGC803细胞增殖和迁移能力的影响。12、Kaplan-Meier plotter预测分析显示,CFL2高表达与胃癌预后不良密切相关。13、过表达mi R-3189-3p可抑制MGC803细胞乳酸产生,抑制乳酸脱氢酶的活性。14、实时定量PCR结果显示,转染mi R-3189-3p mimics 72小时后,某些糖酵解相关基因表达水平发生明显变化,差异具有统计学意义。15、CFL2过表达促进MGC803细胞乳酸的产生,增强乳酸脱氢酶的活性。16、实时定量PCR结果显示,转染CFL2表达载体48h后,与对照组相比,糖酵解相关基因表达无显著差异。结论:1、S100A4基因表达沉默可使MGC803细胞中miR-3189-3p的表达下调。2、MiR-3189-3p抑制MGC803细胞的增殖、迁移和干细胞样特性。3、MiR-3189-3p增强S100A4-siRNA对MGC803细胞增殖、迁移及干细胞样特性的抑制作用。4、CFL2是mi R-3189-3p下游直接靶基因,介导mi R-3189-3p对胃癌细胞增殖和迁移的影响。5、Mi R-3189-3p可抑制MGC803细胞的糖酵解,而CFL2促进MGC803细胞的糖酵解。