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目的:本研究致力于构建组织工程生物活性小血管。首先用猪脱细胞的小肠粘膜下层(Small intestinal submucosa,SIS)交联肝素与分泌型Klotho(Secreted Klotho,SKL),再人工缝制成管状小血管,移植入新西兰大白兔模型中,替代一部分自体颈动脉血管。分别于术后2、3个月后取材,通过蛋白免疫印迹法(Western Blot),组织学染色,免疫荧光等实验技术手段,观察颈动脉管壁的变化与内皮化等相关指标的表达情况,以探讨SKL修饰的人工血管在替代受损血管中发挥的作用,以及内皮化的情况,为构建组织工程化小血管提供实验基础。方法:1.体外条件下培养HEK293细胞,将其分为两组,N组和SKL组。N组为正常组,转染空载体。SKL组转染带有SKL基因的质粒。用Western Blot技术分别对转染后的培养基及细胞中的SKL蛋白进行检测分析。收集转染之后的HEK293细胞的无血清培养基,用蛋白纯化镍柱对SKL蛋白进行提取与纯化。2.体外:将肝素和纯化后的SKL蛋白交联到脱细胞SIS膜上,分为SIS膜,SIS膜+肝素,SIS膜+肝素+SKL三组,将人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)种植于SIS膜上。通过扫描电镜,细胞增殖与细胞毒性实验(Cell Counting Kit-8,CCK-8),Western Blot,免疫荧光手段来检测SKL对内皮细胞粘附及增殖的影响。3.体内:在片状SIS膜上先后交联肝素与SKL蛋白,缝制成直径为2mm的管状,移植入新西兰大白兔的颈动脉中替代自体动脉。将实验动物分为三组,N组,SIS+肝素组,SIS+肝素+SKL组。N组为正常组,不作任何处理;SIS+肝素组,SIS+肝素+SKL组,分别将交联肝素,肝素与SKL蛋白的人工血管移植入兔颈动脉中,分别于2月和3月后取材进行各种指标的检测。通过HE染色和Masson染色,来观察正常组和各实验组动脉壁的管径变化与肌纤维的情况。通过免疫荧光CD31和eNOS来检测内皮化情况,α-SMA检测平滑肌细胞再生。结果:1.Western Blot检测HEK293细胞及培养基中SKL的表达情况,均发现SKL组相对N组表达增高。2.体外:扫描电镜显示SKL处理组SIS膜上粘附的内皮细胞数量最多,且形态最舒展。CCK-8实验显示SKL对细胞无毒性,具有促进细胞增殖作用。Western Blot实验显示SKL组p-FAK,FAK,RHOA各指标的表达量均比N组高。免疫荧光也显示SKL组的FAK,Rac1,RHOA表达量均比肝素组高。3.体内:超声和HE结果显示,肝素组的血管管径较对照组有一定的扩张,SKL组管径比肝素组小很多,接近兔正常动脉管径。Masson染色显示SKL组同肝素组比较,肌纤维含量显著升高。免疫荧光显示SKL组的CD31,e NOS,α-SMA表达量均高于肝素组,且3月份取材的样品比2月份取材的样品表达量高。结论:SKL修饰的SIS小血管能很好的促进血管内皮化,对于组织工程小血管的构建具有重要的意义。