精子携带的RNA在哺乳动物胚胎发育中起着至关重要的作用,精子中包含的micro RNA（miRNA）和内源性小干扰RNA（si RNA）都是胚胎正常发育所必需的。本课题组前期通过卵母细胞和精子的高通量测序筛选出了牛精源性miR-301a,并进行了精源性验证,通过生物信息学分析预测其可能调控的靶基因,发现SMAD5 m RNA 3’-UTR结合位点的保守性及其在卵母细胞中的表达较高。因此本研究以miR-301a及SMAD5为研究对象,通过双荧光素酶报告试验、免疫荧光染色、Western Blot和RTPCR检测等方法,验证miR-301a与SMAD5的靶向调控关系,并就miR-301a靶向SMAD5对牛早期胚胎发育的影响进行研究。主要的研究内容及结果如下:1.通过构建SMAD5 m RNA 3’-UTR结合位点野生型及突变型载体,将其与miR-301a mimic共转染293T细胞并进行双荧光素酶报告基因检测,结果显示miR-301a mimic能显著下调SMAD5野生型试验组的相对荧光强度,证实了miR-301a与SMAD5的靶向关系。进一步向牛成纤维细胞中转染miR-301a mimic,通过实时荧光定量PCR及Western Blot检测了SMAD5的m RNA含量和蛋白表达情况,发现miR-301a能够同时抑制SMAD5转录水平与蛋白水平的表达。2.运用实时荧光定量PCR及免疫荧光染色分别检测了孤雌激活（Parthenogenetic,PA）胚胎及体外受精（In Vitro Fertilization,IVF）胚胎8-细胞前不同卵裂阶段（MⅡ、2-细胞期、4-细胞期、8-细胞期）胚胎中SMAD5的表达情况。结果显示SMAD5 m RNA在IVF胚胎2-细胞期存在显著的下调,推测miR-301a靶向SMAD5在2-细胞之前开始发挥下调作用。向PA胚胎中显微注射miR-301a mimic后,发现SMAD5的表达在2-细胞时期显著下调且表达水平和IVF 2-细胞时期无明显差异,证实miR-301a靶向SMAD5在2-细胞之前已开始发挥下调作用。3.体细胞核移植（Somatic Cell Nuclear Transfer,SCNT）重构胚孤雌激活前显微注射miR-301a mimic和IVF胚胎受精8 h显微注射miR-301a inhibitor后检测2-细胞期胚胎中SMAD5的表达及胚胎的发育情况。结果显示,注射miR-301a mimic后SCNT组2-细胞胚SMAD5的表达显著下降,同时囊胚率显著提高,囊胚质量显著改善。而注射miR-301a inhibitor的IVF胚胎SMAD5的表达显著上升,囊胚率下降。这些结果进一步证实了牛胚胎中miR-301a与SMAD5的靶向调控关系。4.通过对SCNT胚胎注射si RNA敲降SMAD5后检测胚胎的发育情况。结果显示,敲降SMAD5后胚胎的卵裂率无明显变化,但囊胚率及囊胚内细胞团与滋养层细胞的细胞数比例显著提高,该结果与注射miR-301a mimic的SCNT胚胎表型一致。以上研究结果表明,精源性miR-301a可随受精过程被带入卵母细胞,通过靶向下调SMAD5的表达影响牛早期胚胎发育,提高牛早期胚胎发育的囊胚率并改善囊胚质量。