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研究背景和目的:卵巢癌是女性生殖系统三大恶性肿瘤之一,且死亡率最高,其中上皮性卵巢癌（epithelial ovarian cancer,EOC）占卵巢癌的85%-90%,严重威胁女性健康。由于卵巢癌早期症状不明显,就诊率低,缺乏有效的早期诊断手段,大多数患者在确诊时已是晚期,手术治疗和化疗是主要的治疗方法,而化疗药物的耐药性大大降低了患者的预后,因此在精准医学的时代背景之下,探索新的早期诊断卵巢癌的标志物以及治疗的新靶点对提高患者生存期至关重要。外泌体含有DNA、RNA、蛋白质、脂质等多种活性物质,是重要的细胞间信息及遗传物质传递载体,广泛分布于血液、尿液等体液中,并可以通过调控肿瘤细胞与微环境中的免疫细胞之间的相互作用促进肿瘤进展。miRNAs是一类长度为19～25 nt的内源性非编码RNAs,能通过与靶基因m RNAs特异性的碱基互补配对,引起靶基因m RNAs的降解或者抑制其翻译,广泛地负调控靶基因的表达,从而参与恶性肿瘤发生、发展。巨噬细胞作为肿瘤微环境中一类重要的免疫细胞,其高度浸润与肿瘤的发生发展密切相关。巨噬细胞主要存在两种极化状态:经典活化的M1型巨噬细胞和替代活化的M2型巨噬细胞。M1型巨噬细胞对恶性肿瘤细胞具有杀伤和抑制的作用,相反M2型巨噬细胞可以促进肿瘤的生长、血管生成和癌细胞的转移。有学者对EOC患者血浆外泌体中差异表达的miRNAs进行了测序分析,结果发现miR-200b等miRNAs在EOC患者血浆外泌体中显著高表达。既往研究表明肿瘤来源的外泌体miR-19b-3p能促进M2巨噬细胞极化,从而促进肺腺癌的转移,那么,外泌体miR-200b能否通过调控肿瘤微环境中巨噬细胞的极化状态来影响EOC的进展呢?我们对miR-200b的靶基因进行预测分析,发现miR-200b可与KLF6 3’UTR结合。KLF6已被证实参与巨噬细胞极化的调控。因此,我们推测:miR-200b在EOC血浆外泌体中高表达,且miR-200b可能通过调控KLF6的表达水平,调节巨噬细胞的极化,从而促进EOC的进展。为验证假说:我们分离并鉴定EOC患者和正常女性血浆外泌体,检测miR-200b在血浆外泌体中的表达情况;其次,通过M0巨噬细胞转染miR-200b mimic/mimic NC,检测miR-200b对巨噬细胞极化方向的影响;同时CCK-8、transwell等观察不同极化方向的巨噬细胞对卵巢癌细胞增殖、侵袭的影响;最后,通过qRT-PCR、western blot和荧光素酶活性实验等进一步证实miR-200b与KLF6 3’UTR直接结合,探寻miR-200b调控巨噬细胞极化的分子机制。本项目的开展为寻找EOC早期诊断的标志物提供新的方向,同时为miR-200b/KLF6通路作为EOC治疗的新靶点提供新的策略。第一部分:miR-200b在正常女性和EOC患者血浆外泌体中的表达水平的研究目的:尝试从正常女性和EOC患者血浆中提取外泌体,并分析外泌体中miR-200b的表达水平,为寻找EOC早期诊断的标志物提供新的方向。方法:1.采集3名健康女性、6名在我院未经治疗的上皮性卵巢癌（EOC）患者外周血样本。使用Exo Quick?外泌体分离试剂盒提取血浆外泌体。随后,利用透射电子显微镜（TEM）分析外泌体形态,Nano Sight NS300纳米粒子示踪技术（NTA）检测外泌体大小。采用Western blot技术检测外泌体标志物溶酶体相关膜蛋白1（lysosome-associated membrane protein 1,LAMP-1）、肿瘤易感基因101（tumor susceptibility gene101,TSG101）表达。2.采用qRT-PCR检测正常女性和EOC患者血浆外泌体中miR-200b的差异表达水平。结果:1.采用透射电镜观察外泌体形态,透射电镜下观察外泌体呈典型的圆形和蝶形结构特征。2.采用NTA技术分析外泌体粒径,外泌体直径峰值在100 nm左右。3.采用Western blot检测外泌体标志蛋白,结果显示在正常女性外泌体及EOC患者的外泌体中均有TSG101及LAMP-1的表达。4.采用qRT-PCR检测上述分离的两组血浆外泌体中miR-200b的表达水平,结果显示miR-200b在EOC患者血浆外泌体中显著高表达（P＜0.05）。结论:1.成功分离并鉴定正常女性和EOC患者血浆外泌体。2.EOC组患者血浆外泌体miR-200b的表达水平显著高于正常女性组,为外泌体miR-200b作为早期诊断卵巢癌的标志物提供了一定的理论依据。第二部分miR-200b调控巨噬细胞极化对EOC细胞增殖、侵袭的影响研究目的:探讨miR-200b通过调控巨噬细胞的极化方向,从而影响EOC细胞的增殖和侵袭。方法:1.将人单核细胞系THP-1细胞培养在含10%胎牛血清、1%链霉素/青霉素及0.05 n Mβ-巯基乙醇的RPMI-1640培养基中培养。培养环境为5%CO2、37?C。50 ng/m L phorbol-12-myristate 13-acetate（PMA）用于诱导THP-1细胞向巨噬细胞表型分化。与PMA共同孵育48小时后,收集THP-1细胞,命名为M0巨噬细胞。2.使用转染试剂Lipofectamine 2000将miR-200b mimic、mimic NC等转染到M0巨噬细胞中。24小时后收集细胞,采用qRT-PCR检测miR-200b的过表达效率。3.室温条件下,将细胞与PE标记的CD206抗体、FITC标记的CD86抗体共同孵育30分钟。随后,使用BD Accuri?C6流式细胞仪检测M1（CD86+）和M2型（CD206+）巨噬细胞的比例。4.分别采用Anti-CD86和Anti-CD206免疫荧光抗体标记转染miR-200b mimic及mimic NC的M0细胞。在共聚焦显微镜下观察CD86阳性和CD206阳性细胞。5.采用qRT-PCR检测分别转染miR-200b mimic及mimic NC的M0细胞中M1型标志物i NOS m RNA和M2型标志物Arg-1 m RNA的表达水平。6.ELISA检测M1型细胞因子IL-1β和M2型趋化因子CCL-17的水平。7.收集研究中M0以及分别转染miR-200b mimic及mimic NC的M0细胞培养液,将其与EOC细胞株OVCAR-3共孵育（PBS为对照）。采用CCK-8检测对细胞增殖的影响。transwell检测细胞侵袭能力。结果:1.使用转染试剂Lipofectamine 2000将miR-200b mimic转染到M0巨噬细胞显著促进了细胞miR-200b的表达（P＜0.05）。2.流式细胞术结果显示,经miR-200b mimic处理后,CD86阳性细胞的百分比明显降低（P＜0.05）,但CD206阳性细胞的百分比显著上调（P＜0.05）。3.免疫荧光结果显示,经miR-200b mimic处理后,M0巨噬细胞中CD86阳性细胞（M1型巨噬细胞）明显减少（P＜0.05）,而CD206阳性细胞（M2型巨噬细胞）的数目显著增加（P＜0.05）。4.与转染mimic NC的M0巨噬细胞相比,转染miR-200b mimic的M0巨噬细胞的i NOS m RNA表达水平明显降低（P＜0.05）,而Arg-1 m RNA的表达水平明显升高（P＜0.05）。5.与转染mimic NC的M0巨噬细胞相比,转染miR-200b mimic的M0巨噬细胞培养上清液中M1巨噬细胞相关细胞因子（Interleukin 1β,IL-1β）浓度显著下降（P＜0.05）,M2巨噬细胞相关趋化因子（Chemokines 17,CCL-17）浓度显著升高（P＜0.05）。6.与PBS相比,M0巨噬细胞条件培养基不仅显著抑制了EOC细胞增殖活性,而且显著抑制了EOC细胞的侵袭能力（P＜0.05）。7.与mimic NC相比,miR-200b mimic条件培养基不仅显著增强了EOC细胞增殖活性,并且显著增强了EOC细胞的侵袭能力（P＜0.05）。结论:1.miR-200b促进巨噬细胞向M2的极化,抑制巨噬细胞向M1的极化。2.miR-200b通过诱导巨噬细胞向M2极化促进EOC细胞的增殖和侵袭。第三部分miR-200b调控巨噬细胞极化的分子机制研究目的:探讨miR-200b调控巨噬细胞极化方向的分子机制。方法:1.采用star Base v2.0数据库分析miR-200b-3p与KLF6 3’-UTR结合位点。通过构建KLF6 3’UTR wt和KLF6 3’UTR mut荧光素酶报告载体并与miR-200b mimic或mimic NC共转染293T细胞,采用荧光素酶活性实验证明miR-200b与KLF6 3’UTR直接结合。2.在M0细胞中分别转染miR-200b mimic及mimic NC,或miR-200b inhibitor及inhibitor NC,采用qRT-PCR和western blot检测KLF6的表达水平。3.在M0细胞中同时共转染miR-200b mimic和KLF6过表达载体。流式细胞术检测M1和M2型巨噬细胞的比例;qRT-PCR检测M1型标志物i NOS m RNA和M2型标志物Arg-1 m RNA的表达水平;ELISA检测M1型细胞因子IL-1β和M2型趋化因子CCL-17的水平。结果:1.生物信息学预测显示,KLF6 3’UTR具有miR-200b的靶向结合序列。荧光素酶报告基因实验证实,miR-200b可以直接靶向结合KLF6 3’UTR。2.转染miR-200b mimic组的M0巨噬细胞中,KLF6 m RNA和蛋白的表达水平显著低于转染mimic NC组（P＜0.05）;而转染miR-200b inhibitor组的M0巨噬细胞中,KLF6 m RNA和蛋白的表达水平显著上调（P＜0.05）。3.miR-200b mimic转染后,M0巨噬细胞被表达KLF6的慢病毒感染,流式细胞仪测定M1和M2巨噬细胞百分比,KLF6的过表达可以明显逆转miR-200b对M0巨噬细胞向M1型极化的抑制作用;同时KLF6也可以显著逆转miR-200b对M0巨噬细胞向M2型极化的促进作用。KLF6的过表达逆转了miR-200b对M1型标志物i NOS m RNA表达的抑制和miR-200b对M2型标志物Arg-1 m RNA表达的促进作用。此外,KLF6过表达逆转了miR-200b对IL-1β分泌的抑制作用和对CCL-17分泌的促进作用。结论:KLF6和miR-200b存在靶向互作关系。KLF6的过表达可逆转miR-200b对巨噬细胞向M1极化的抑制和对巨噬细胞向M2极化的促进作用。