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背景:随着社会经济发展和人口老龄化程度不断提高,心血管疾病（Cardiovascular Diseases,CVD）的发病率已经逐渐超越癌症,伴随而来的高致残率、高致死率,已经对人们的健康造成了极大的威胁。心血管疾病的发生涉及许多因素。老龄化作为心血管疾病的一个独立危险因素,可引起血管结构和生理功能的变化,其中,内皮细胞发生衰老,随之出现损伤和生理功能障碍。这一变化已被证实参与了动脉粥样硬化,与心血管疾病的发生和发展密切相关。然而,内皮细胞是如何出现衰老表型,衰老又是如何影响内皮细胞功能,进一步影响血管功能,最终导致衰老相关心血管疾病,其表现与相关机制仍需进一步研究。微小RNA（MicroRNAs,miRNAs）是目前较为火热的一个基础研究领域,研究已经表明多种miRNAs参与了心血管疾病的发生与发展,其中也包括内皮细胞的衰老过程。本研究选取了在衰老人脐静脉内皮细胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cell,HUVEC）中表达上调的miR-204,其是否参与内皮细胞衰老过程及相关作用机制仍不清楚。因此,本研究旨在体外模拟内皮细胞复制性衰老过程,检测miR-204表达水平,并观察其对内皮细胞衰老表型和生物学功能的影响,进一步探究其可能调控的衰老相关基因沉默信息调节因子1（Sirtuin1,SIRT1）的表达水平。为发现新的内皮细胞衰老标志物和抗内皮细胞衰老的治疗方法开拓新思路。目的:通过体外实验探究miR-204对人脐静脉内皮细胞衰老及生物学功能的影响。研究方法:1、在GEO（Gene Expression Omnibus,GEO）数据库中检索人脐静脉内皮细胞数据集,选择并下载包含年轻和衰老HUVEC的miRNA表达谱数据集,通过GEO2R分析数据,筛选出具有明显表达差异的miRNAs并使用R语言包制作火山图及热图。2、以HUVEC为研究对象,HUVEC成功复苏后,使用群体倍增水平（Population Doubling Level,PDL）通过连续传代培养不同代次（PDL8、PDL20、PDL40）HUVEC,建立HUVEC复制性衰老模型,光镜下观察不同代次HUVEC形态,采用衰老相关β-半乳糖苷酶（Senescence-associatedβ-galactosidase,SA-β-gal）法检测不同代次细胞中衰老HUVEC的比例,采用实时荧光定量PCR法检测PDL8、PDL40 HUVEC细胞周期基因p53、p21的表达水平,验证HUVEC复制性衰老模型成功建立。3、采用实时荧光定量PCR法检测PDL8、PDL20、PDL40 HUVEC中miR-204的表达水平。为了探究miR-204在HUVEC衰老过程中的作用,向HUVEC瞬时转染miR-204 mimic、miR-204inhibitor并分设对照组。通过SA-β-gal法探究miR-204对HUVEC衰老程度的影响,划痕实验探究miR-204对HUVEC迁移能力的影响,Ed U实验探究miR-204对HUVEC增殖能力的影响,管成形实验探究miR-204对HUVEC成血管能力的影响。4、通过Western blot实验检测miR-204对SIRT1蛋白表达的调控作用。通过miRNA靶基因预测工具Target Scan数据库预测miR-204可能有结合位点的靶基因。研究结果:1、通过miRNA表达谱分析结果表明,与年轻HUVEC相比,miR-204在衰老HUVEC中高表达。2、复苏后的HUVEC光镜下表现为扁平、短梭形,呈鹅卵石样紧密排列,随着HUVEC传代次数增加,细胞出现大小不均,体积增大,形态肿胀不规则,失去鹅卵石样紧密排列,SA-β-gal蓝染细胞比例增加,PDL40 HUVEC中细胞周期相关基因p53、p21表达水平上调,表明成功建立HUVEC体外复制性衰老模型。3、与PDL8 HUVEC相比,miR-204在PDL20 HUVEC、PDL40 HUVEC中表达上调。在PDL20HUVEC中,转染miR-204 mimic增加了SA-β-gal蓝染细胞比例,转染miR-204 inhibitor则减少了SA-β-gal蓝染细胞比例。转染miR-204 mimic抑制了PDL8 HUVEC迁移、增殖、血管形成能力,抑制了PDL40 HUVEC迁移能力。转染miR-204 inhibitor提高了PDL40HUVEC迁移、增殖能力。4、Western blot验证了miR-204和SIRT1蛋白表达的负相关性。Target Scan预测SIRT1可能是miR-204的靶基因。研究结论:1、本研究通过体外传代培养技术及鉴定成功建立了HUVEC复制性衰老模型,模拟了体外内皮细胞的复制衰老过程。2、转染miR-204模拟物及抑制物后改变了HUVEC SA-β-gal蓝染细胞比例,表明了miR-204可能参与了内皮细胞衰老过程。过表达miR-204后抑制了年轻内皮细胞的迁移、增殖、成血管能力,进一步抑制了衰老内皮细胞的迁移能力,而抑制miR-204可部分改善衰老内皮细胞的迁移、增殖能力,提示miR-204可能调控衰老相关的内皮细胞生物学功能。3、MiR-204参与内皮细胞衰老、调节内皮细胞生物学功能可能通过负性调节SIRT1蛋白表达而作用的。Target Scan预测SIRT1可能是miR-204靶基因。4、上述结果提示miR-204可能作为内皮细胞衰老相关标志物,预测衰老相关心血管疾病风险,并且可能作为一个靶点,调控内皮细胞生物学功能。